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【摘 要】 目的：观察畲药“十二时辰”醇提液皮肤用药的慢性毒性作用，初步评价其皮肤长期用药的安全性。方法：采用新西兰家兔进行皮肤用药30d涂皮慢性毒性试验，固定涂药时间，连续30d，末次给药后进行血常规、血液生化指标、脏器指数及组织病理学检查。结果：畲药“十二时辰”醇提液用于家兔皮肤慢性毒性实验期间，动物生长发育良好，血常规、血液生化指标、脏器指数及组织病理学检查与对照组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。结论：畲药“十二时辰”醇提液皮肤长期用药对家兔无明显毒性，是较安全的皮肤外用药。
【关键词】 重瓣铁线莲;皮肤用药;慢性毒性
【中图分类号】R285.5 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2020）1-0021-04
“十二时辰”为福建福安民间畲医习用药，根据《福安畲医畲药》记载，其性温，味辛，具有通经活络、通关窍、祛风除湿、活血止痛、理气通便、利尿等功效[1]，黄泽豪等[2]对其进行本草考证，福安“十二时辰”为毛茛科植物重瓣铁线莲Clematis florida Thunb.var.plena D.Don的干燥根。重瓣铁线莲具有多种生物活性化学成分，林玲等[3]对福安的重瓣铁线莲的化学成分进行分析，发现其可能含有氨基酸、蛋白质、还原糖、多糖、皂苷类、生物碱、黄酮类以及少量的酚类和鞣质、有机酸、内酯、香豆素、挥发油、甾体和萜类等化学成分。现代药理研究表明具有抗炎、抗肿瘤、祛风除湿、解毒消肿等作用。叶丽颖等[4]发现铁线莲提取物具有一定的抗氧化能力和抑菌能力，能抑制脂质体过氧化，清除超氧阴离子;能抑制金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌和枯草芽孢杆菌的生长。
“十二时辰”作为畲族民间习用药，具有鲜明的地方与民族特色。当地居民用“十二时辰”泡酒，药液作为皮肤外用药，用来治疗跌打损伤，关节肿痛等。本实验室前期观察到“十二时辰”水煎剂小鼠灌胃急性毒性的半数致死量为60.08g/kg[5]。为分析“十二时辰”醇提液作为皮肤用药的毒性，项目组参照《中药药理研究方法学》皮肤用药毒性试验方法[6]，进行“十二时辰”皮肤用药慢性毒性试验，现报告如下。
1 仪器与材料
1.1 实验动物 新西兰家兔，雌雄各半，（1.5±0.2）kg，购自上海市松江区松联实验动物场，合格证号：20170008000087。
1.2 药物 “十二时辰”生药（闽东畲族青草药发展协会提供），经福建中医药大学范世明教授鉴定为毛茛科植物重瓣铁线莲Clematis florida Thunb.var.plena D.Don 的干燥根，本实验采用65%的乙醇提取浓缩制备，每毫升含生药1.0g。 诗妃脱毛膏（批号：PSHG028，广州诗妃生物科技有限公司）。
1.3 仪器 YP502N电子天平（上海精密科学有限公司）;AU480全自动生化仪（贝克曼）;XT2000i全自动血液分析仪（SYSMEX）;DMi8显微镜（LEICA）
2 方法
2.1 分组 通过前期的皮肤用药急性毒性试验，未观察到毒性反应，可能是毒性较小，则采用最大浓度最大耐受量进行家兔慢性毒性试验，最大浓度为1.0g/mL原药材。将健康的新西兰家兔随机分成4组，即正常对照组（涂赋形剂30%乙醇）、“十二时辰”高剂量组（1.0g/mL）、中剂量组（0.5g/mL）、低剂量组（0.25g/mL），每组6只，雌雄各半。
2.2 给药方法与观察[7] 给药前24h先用电推剪在背部剃毛，然后用诗妃脱毛膏脱毛，脱毛面积约150cm2。给药途径与临床一致，采用皮肤给药，每只家兔脱毛区固定时间涂药5mL，涂药后用纱布固定， 家兔分笼饲养，连续用药30d。末次给药后动物禁食不禁水16h，用10% 的水合氯醛进行腹腔注射麻醉。将麻醉后的动物仰卧固定，使用一次性采血针从腹主动脉采血，血样用于血常规和血生化检测。采血完后处死动物，解剖动物，摘取动物下列脏器：脑、心、肝、脾、肺、肾（单側）、胸腺、肾上腺（单侧）、睾丸（单侧）、附睾（单侧）子宫、卵巢（单侧）分别称重，并计算主要脏器系数。计算公式如下：
脏器系数=脏器重量/体重×100%
2.3 HE染色病理切片 检查称重后，各脏器均浸入4%多聚甲醛溶液中进行固定，用于HE（hematoxylin-eosin staining）染色病理切片。将固定后的主要脏器（心、肝、脾、肺、肾）进行修样后，在脱水机内进行梯度脱水及透明。将脱水后的样本取出，进行石蜡包埋。将包埋后的组织样本固定在切片机上切片，然后在温水（42～46℃）中展平、贴片，最后置入烘箱内过夜烘干。次日在二甲苯和乙醇浓度梯度中使切片脱蜡，然后进行HE染色，最后进行显微镜检查并拍照。
2.4 统计学方法 资料采用SPSS14.0 软件进行统计分析，方差齐时两均数比较用LSD，方差不齐用秩和检验，进行统计学分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
3 结果
3.1 一般情况和体重增长的影响 用药组与对照组相比，未观察到家兔的活动、 饮食、皮毛光泽的异常，家兔体重随时间推移而增加，与正常对照组比无明显变化（P>0.05）（见表l） 。结果显示“十二时辰”醇提液皮肤用药30d对家兔的体重变化无影响。
3.2 对家兔主要脏器的脏器系数的影响 取家兔心、脑、肝、脾、肺、肾、胸腺等主要脏器称重并计算其脏器指数，结果发现各组家兔主要脏器的脏器系数与正常对照组比较均无统计学差异（P>0.05）。 说明“十二时辰”醇提液皮肤用药30天对家兔的主要脏器无影响。见表2。
3.3 对家兔血常规的影响 取各组家兔的血清进行血常规检查，各给药组连续涂抹“十二时辰”醇提液30d后对家兔血常规无明显影响，均在正常值范围内。见表3。 3.4 对家兔血液生化的影响对各组家兔血清进行血液生化检测，给药组连续涂抹“十二时辰”醇提液30d后对家兔血生化指标无明显影响，均在正常值范围内。见表4。
3.5 对组织学的影响 取各组家兔的心、肝、脾、肺、肾、等各脏器组织进行HE染色，显微镜拍照，由图1可知，“十二时辰”醇提液皮肤用药30d对家兔主要脏器的组织形态正常，界限分明，未见明显异常。
4 讨论
实验室前期对“十二时辰”水煎剂作为内服的毒性进行了评价，发现其水煎剂小鼠灌胃有一定的毒性作用，半数致死量 （LD50）为60.08g/kg[5] 。其口服有一定的毒性反应，那么作为外用制剂，是否也会有一定的毒性反应。本实验室采用醇提液进行了一系列的皮肤用药安全性评价试验，皮肤给药急性毒性试验、皮肤刺激试验、皮肤过敏试验，均未见毒性反应。
本次实验用十二时辰对家兔皮肤进行30d涂皮实验研究，在本实验条件下，30d涂皮试验的3个剂量组（5.0、2.5、1.25g生药/只），其体重、血常规和生化检测指标，与正常对照组比较，差异均无统计学意义（P>0.05），HE染色病理组织学检查结果也表明各试验组家兔的心、肝、脾、肺、肾睾丸、卵巢等组织均未见病理性损伤。表明该样品外用涂皮对家兔的生长发育无不良影响。对畲药“十二时辰”醇提液外用于活血化瘀，治疗跌打损伤，关节肿痛等临床具有积极的参考价值。
畲药“十二时辰”属于福建福安地区畲族药，在当地已有100多年的使用历史，具有鲜明的地方与民族特色，现在当地开始进行大量的人工栽培，是当地农民经济收入来源的一大部分，其在畲族民间也得到广泛应用，民间既可用它作为观赏性花卉，又可用它泡酒或熬汤当作内服，还有的用它做成洗剂和搽剂用作外用。但目前对“十二时辰”的药理药效研究较少，特别是安全性方面的实验评价。为了有效避免民间应用时可能造成不良反应，为保障福建草药民间的用药安全。本实验结果为“十二时辰”的外用制剂的开发利用提供了科学依据，从而为带动当地畲族的经济和畲医畲药的发展提供一些理论基础。
参考文献
[1]钟隐芳. 福安畲医畲药[M].福州：海风出版社，2010：109-110.
[2]黃泽豪，张月玲. 畲药十二时辰的本草考证[J]. 中国民族民间医药，2014，23 （1）：2-3，5.
[3]林玲，朱扶蓉. 重瓣铁线莲提取物化学成分初步研究[J]. 医药前沿，2014，4（26）：34-36.
[4]叶丽颖，腾春福，吴楠，等. 畲药铁线莲提取物的生物活性初步研究[J]. 海峡药效，2015，27（2）：41-45.
[5]张继州，周春权，李细彬，等. 畲药“十二时辰”水煎剂的急性实验研究[J]. 中国民族民间医药，2017，26 （8）：27-28.
[6]陈奇. 中药药理研究方法学[M].3版.北京：人民卫生出版社，2011：139-145.
[7]国家药品食品监督管理局.中药、天然药物长期毒性研究技术指导原则[M].北京：人民卫生出版社，2005.
（收稿日期：2018-10-29 编辑：程鹏飞）
【关键词】 重瓣铁线莲;皮肤用药;慢性毒性
【中图分类号】R285.5 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2020）1-0021-04
“十二时辰”为福建福安民间畲医习用药，根据《福安畲医畲药》记载，其性温，味辛，具有通经活络、通关窍、祛风除湿、活血止痛、理气通便、利尿等功效[1]，黄泽豪等[2]对其进行本草考证，福安“十二时辰”为毛茛科植物重瓣铁线莲Clematis florida Thunb.var.plena D.Don的干燥根。重瓣铁线莲具有多种生物活性化学成分，林玲等[3]对福安的重瓣铁线莲的化学成分进行分析，发现其可能含有氨基酸、蛋白质、还原糖、多糖、皂苷类、生物碱、黄酮类以及少量的酚类和鞣质、有机酸、内酯、香豆素、挥发油、甾体和萜类等化学成分。现代药理研究表明具有抗炎、抗肿瘤、祛风除湿、解毒消肿等作用。叶丽颖等[4]发现铁线莲提取物具有一定的抗氧化能力和抑菌能力，能抑制脂质体过氧化，清除超氧阴离子;能抑制金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌和枯草芽孢杆菌的生长。
“十二时辰”作为畲族民间习用药，具有鲜明的地方与民族特色。当地居民用“十二时辰”泡酒，药液作为皮肤外用药，用来治疗跌打损伤，关节肿痛等。本实验室前期观察到“十二时辰”水煎剂小鼠灌胃急性毒性的半数致死量为60.08g/kg[5]。为分析“十二时辰”醇提液作为皮肤用药的毒性，项目组参照《中药药理研究方法学》皮肤用药毒性试验方法[6]，进行“十二时辰”皮肤用药慢性毒性试验，现报告如下。
1 仪器与材料
1.1 实验动物 新西兰家兔，雌雄各半，（1.5±0.2）kg，购自上海市松江区松联实验动物场，合格证号：20170008000087。
1.2 药物 “十二时辰”生药（闽东畲族青草药发展协会提供），经福建中医药大学范世明教授鉴定为毛茛科植物重瓣铁线莲Clematis florida Thunb.var.plena D.Don 的干燥根，本实验采用65%的乙醇提取浓缩制备，每毫升含生药1.0g。 诗妃脱毛膏（批号：PSHG028，广州诗妃生物科技有限公司）。
1.3 仪器 YP502N电子天平（上海精密科学有限公司）;AU480全自动生化仪（贝克曼）;XT2000i全自动血液分析仪（SYSMEX）;DMi8显微镜（LEICA）
2 方法
2.1 分组 通过前期的皮肤用药急性毒性试验，未观察到毒性反应，可能是毒性较小，则采用最大浓度最大耐受量进行家兔慢性毒性试验，最大浓度为1.0g/mL原药材。将健康的新西兰家兔随机分成4组，即正常对照组（涂赋形剂30%乙醇）、“十二时辰”高剂量组（1.0g/mL）、中剂量组（0.5g/mL）、低剂量组（0.25g/mL），每组6只，雌雄各半。
2.2 给药方法与观察[7] 给药前24h先用电推剪在背部剃毛，然后用诗妃脱毛膏脱毛，脱毛面积约150cm2。给药途径与临床一致，采用皮肤给药，每只家兔脱毛区固定时间涂药5mL，涂药后用纱布固定， 家兔分笼饲养，连续用药30d。末次给药后动物禁食不禁水16h，用10% 的水合氯醛进行腹腔注射麻醉。将麻醉后的动物仰卧固定，使用一次性采血针从腹主动脉采血，血样用于血常规和血生化检测。采血完后处死动物，解剖动物，摘取动物下列脏器：脑、心、肝、脾、肺、肾（单側）、胸腺、肾上腺（单侧）、睾丸（单侧）、附睾（单侧）子宫、卵巢（单侧）分别称重，并计算主要脏器系数。计算公式如下：
脏器系数=脏器重量/体重×100%
2.3 HE染色病理切片 检查称重后，各脏器均浸入4%多聚甲醛溶液中进行固定，用于HE（hematoxylin-eosin staining）染色病理切片。将固定后的主要脏器（心、肝、脾、肺、肾）进行修样后，在脱水机内进行梯度脱水及透明。将脱水后的样本取出，进行石蜡包埋。将包埋后的组织样本固定在切片机上切片，然后在温水（42～46℃）中展平、贴片，最后置入烘箱内过夜烘干。次日在二甲苯和乙醇浓度梯度中使切片脱蜡，然后进行HE染色，最后进行显微镜检查并拍照。
2.4 统计学方法 资料采用SPSS14.0 软件进行统计分析，方差齐时两均数比较用LSD，方差不齐用秩和检验，进行统计学分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
3 结果
3.1 一般情况和体重增长的影响 用药组与对照组相比，未观察到家兔的活动、 饮食、皮毛光泽的异常，家兔体重随时间推移而增加，与正常对照组比无明显变化（P>0.05）（见表l） 。结果显示“十二时辰”醇提液皮肤用药30d对家兔的体重变化无影响。
3.2 对家兔主要脏器的脏器系数的影响 取家兔心、脑、肝、脾、肺、肾、胸腺等主要脏器称重并计算其脏器指数，结果发现各组家兔主要脏器的脏器系数与正常对照组比较均无统计学差异（P>0.05）。 说明“十二时辰”醇提液皮肤用药30天对家兔的主要脏器无影响。见表2。
3.3 对家兔血常规的影响 取各组家兔的血清进行血常规检查，各给药组连续涂抹“十二时辰”醇提液30d后对家兔血常规无明显影响，均在正常值范围内。见表3。 3.4 对家兔血液生化的影响对各组家兔血清进行血液生化检测，给药组连续涂抹“十二时辰”醇提液30d后对家兔血生化指标无明显影响，均在正常值范围内。见表4。
3.5 对组织学的影响 取各组家兔的心、肝、脾、肺、肾、等各脏器组织进行HE染色，显微镜拍照，由图1可知，“十二时辰”醇提液皮肤用药30d对家兔主要脏器的组织形态正常，界限分明，未见明显异常。
4 讨论
实验室前期对“十二时辰”水煎剂作为内服的毒性进行了评价，发现其水煎剂小鼠灌胃有一定的毒性作用，半数致死量 （LD50）为60.08g/kg[5] 。其口服有一定的毒性反应，那么作为外用制剂，是否也会有一定的毒性反应。本实验室采用醇提液进行了一系列的皮肤用药安全性评价试验，皮肤给药急性毒性试验、皮肤刺激试验、皮肤过敏试验，均未见毒性反应。
本次实验用十二时辰对家兔皮肤进行30d涂皮实验研究，在本实验条件下，30d涂皮试验的3个剂量组（5.0、2.5、1.25g生药/只），其体重、血常规和生化检测指标，与正常对照组比较，差异均无统计学意义（P>0.05），HE染色病理组织学检查结果也表明各试验组家兔的心、肝、脾、肺、肾睾丸、卵巢等组织均未见病理性损伤。表明该样品外用涂皮对家兔的生长发育无不良影响。对畲药“十二时辰”醇提液外用于活血化瘀，治疗跌打损伤，关节肿痛等临床具有积极的参考价值。
畲药“十二时辰”属于福建福安地区畲族药，在当地已有100多年的使用历史，具有鲜明的地方与民族特色，现在当地开始进行大量的人工栽培，是当地农民经济收入来源的一大部分，其在畲族民间也得到广泛应用，民间既可用它作为观赏性花卉，又可用它泡酒或熬汤当作内服，还有的用它做成洗剂和搽剂用作外用。但目前对“十二时辰”的药理药效研究较少，特别是安全性方面的实验评价。为了有效避免民间应用时可能造成不良反应，为保障福建草药民间的用药安全。本实验结果为“十二时辰”的外用制剂的开发利用提供了科学依据，从而为带动当地畲族的经济和畲医畲药的发展提供一些理论基础。
参考文献
[1]钟隐芳. 福安畲医畲药[M].福州：海风出版社，2010：109-110.
[2]黃泽豪，张月玲. 畲药十二时辰的本草考证[J]. 中国民族民间医药，2014，23 （1）：2-3，5.
[3]林玲，朱扶蓉. 重瓣铁线莲提取物化学成分初步研究[J]. 医药前沿，2014，4（26）：34-36.
[4]叶丽颖，腾春福，吴楠，等. 畲药铁线莲提取物的生物活性初步研究[J]. 海峡药效，2015，27（2）：41-45.
[5]张继州，周春权，李细彬，等. 畲药“十二时辰”水煎剂的急性实验研究[J]. 中国民族民间医药，2017，26 （8）：27-28.
[6]陈奇. 中药药理研究方法学[M].3版.北京：人民卫生出版社，2011：139-145.
[7]国家药品食品监督管理局.中药、天然药物长期毒性研究技术指导原则[M].北京：人民卫生出版社，2005.
（收稿日期：2018-10-29 编辑：程鹏飞）