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【目的】研究大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）致病基因的功能，构建一个便于筛选敲除转化子的高效基因敲除载体。【方法】通过普通PCR技术扩增得到绿色荧光蛋白基因（GFP），连接到pMD18-T载体上，测序验证，利用限制性内切酶HindⅢ将目的片段切下，连接到敲除载体pRF—HU2的多克隆位点上。通过电击转化法将载体转化到农杆菌EHA105中，利用农杆菌介导法（ATMT）转化到大丽轮枝菌。【结果】成功得到一种新的携带GFP筛选标记的大丽轮枝菌敲除载体，通过GFP基因的筛选，T—DNA随机插