论文部分内容阅读
摘要：目的：检测慢性应激高血压大鼠头端延髓腹外侧区组织中腺苷、cAPM含量的变化，探讨慢性应激下高血压的病理机制。方法：将12只大鼠随机分成Sham组、CS组，采取4周反复刺激构建慢性应激高血压模型，采用超高效液相色谱串联质谱法测定大鼠RVLM区腺苷、cAPM的变化。结果：与Sham组相比，CS组血压升高，腺苷、cAPM含量下调（P<0.01）。结论：本实验成功构建了慢性应激高血压大鼠模型，慢性应激条件下腺苷、cAPM含量下调可能是高血压发生与发展过程中的关键因素。
关键词：慢性应激;高血压;腺苷;cAPM;动物模型
高血压是引起心脑血管疾病的重要因素[1]，随着经济的发展，人们承受的慢性应激也越来越大，这些压力的持续存在给人们带来了严重伤害[2]。本实验采用超高效液相色谱串联质谱法对慢性应激高血压大鼠头端延髓腹外侧区（Rostral Ventrolateral Medulla， RVLM）的腺苷、cAMP进行测定，初步探讨在慢性应激所致高血压发展过程中血管舒张因子的含量变化情况，揭示慢性应激状态下高血压复杂的病理机制。现报道如下：
1材料与方法
1.1 仪器与试剂
1290 Infinity HpLC与6470 TQ MS/MS（安捷伦科技，美国），双极银丝记录电极（北京旭月科技有限公司），示波器（美国Tektronix oscilloscoPe公司），腺苷、cAMP和醋酸铵均购自Sigma（St. Louis， Missouri， USA），氨水购自泰坦科技股份有限公司，乙腈（色谱纯，默克公司），水为超纯去离子水（18.2 M）。
1.2 动物模型的建立
8周龄SPF级SD雄性大鼠12只，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，许可证号：SCXK（沪）2013-0016。动物饲养严格按照国家实验动物饲养和使用指南进行。适应性饲养1周后随机分成Sham组、CS组，每组6只。慢性应激高血压大鼠模型参照相关文献[3]。Sham组除不给予应激刺激外，其他条件与CS组相同。
1.3 血压测定与样本收集
血压测定参照相关文献进行[4]。测量结束后，大鼠行安乐死。断头取出RVLM区组织，-80℃冰箱保存。
1.4 色谱质谱条件
1.4.1 色谱条件
色谱柱HyPercarb Column（3 μm，2.1×100 mm，Thermo Fisher Scientific），柱温35℃。流动相15mM醋酸铵-0.3%氨水（A）-15mM醋酸铵-0.3%氨水-90%乙腈（B），Posttime 3 min。洗脱梯度：0～2 min，3%B;2～10 min，3%～50%B;10～14 min，50%～85%B，14～17 min，85%。流速0.35 ml/min，进样量1 μl。
1.4.2 质谱条件
ESI+动态MRM模式，Gas TemP 350℃，Gas Flow 10 L/min，Nebulizer 40 Psi，SheathGasHeater 350℃，SheathGasFlow 11 L/min，CaPillary 4 000 V，其他参数见表1，色谱图见图1。
1.5 标准品的配制
精密称取标准品10 mg，置于容量瓶中，加入水，配制约1 mg/ml的标准品储备液。
1.6 样品的前处理
精密称取脑组织，加入200 μl甲醇匀浆（60 Hz，60 s）后，离心15 min（12000 g，4℃），取上清液待测。
1.7 统计学方法
采用SPSS21.0对数据进行处理，P<0.05为差异具有统计学意义。
2结果
2.1 两组大鼠血压比较
经4周慢性应激之后，CS组血压显著升高（P<0.01），符合慢性应激高血压的表现。见表2。
2.2 腺苷、cAMP含量测定
2.2.1 线性方程的建立
取标准品储备液，用50%甲醇稀释，按1.4项下进行测定，以浓度为横坐标，以峰面积作为纵坐标绘制标准曲线，结果显示不同浓度腺苷、cAMP与峰面积均具有良好的线性关系，相关系数大于0.999。见表3。
2.2.2 精密度
测定低、中、高浓度腺苷、cAMP，计算精密度。腺苷精密度为0.48%～1.65%（n=6），cAMP精密度为0.96%～3.21%（n=6），说明方法精密度良好。
2.2.3 测定结果
将脑组织按照1.6项下处理，按1.4项下进行测定，结果显示CS组腺苷和cAMP的含量较Sham组显著下调（P<0.01）。见表4。
3討论
腺苷具有舒张血管、对抗室上性心动过速的作用。研究表明，腺苷与血流量大小密切相关，可通过与血管平滑肌的直接作用使血管舒张，血压下降[5]。此外，腺苷可通过腺苷受体A2介导的Gαs使cAMP发生变化[6]。在本实验中，CS组腺苷和cAMP均下调，提示慢性应激所致的高血压可能与MAPK磷酸化程度相关。
本研究通过对腺苷、cAMP的靶向检测，初步推断CS所致高血压可能与腺苷、cAMP的下调相关，并为今后研究慢性应激性高血压的病理机制提供一定参考。
参考文献
[1]Carlene ML，StePhen VH，Anthony R.Global burden of blood-Pressure-related disease， 2001[J].The Lancet，2008，371（9623）：1513-1518.
[2]Tobe SW， Kiss A， Sainsbury S，et al.The imPact of job strain and marital cohesion on ambulatory blood Pressure during 1 year： the double exPosure study[J]. Am J HyPertens，2007，20（2）：148-53.
[3]Elizalde N，García-García AL，Totterdell S，et al.Sustained stress-induced changes in mice as a model for chronic dePression[J].PsychoPharmacology （Berl），2010，210（3）：393-406.
[4]Wu Q， Xia DM， Lan F，et al.UPLC-QTOF/MS-based metabolomics reveals the mechanism of chronic unPredictable mild stress-induced hyPertension in rats[J].Biomed Chromatogr，2019，33（10）：e4619.
[5]Marshall JM.The roles of adenosine and related substances in exercise hyPeraemia[J].J Physiol，2007，583（Pt 3）：835-845.
[6]Schulte G，Fredholm BB.Signalling from adenosine recePtors to mitogen-activated Protein kinases[J].Cell Signal，2003，15（9）：813-827.
关键词：慢性应激;高血压;腺苷;cAPM;动物模型
高血压是引起心脑血管疾病的重要因素[1]，随着经济的发展，人们承受的慢性应激也越来越大，这些压力的持续存在给人们带来了严重伤害[2]。本实验采用超高效液相色谱串联质谱法对慢性应激高血压大鼠头端延髓腹外侧区（Rostral Ventrolateral Medulla， RVLM）的腺苷、cAMP进行测定，初步探讨在慢性应激所致高血压发展过程中血管舒张因子的含量变化情况，揭示慢性应激状态下高血压复杂的病理机制。现报道如下：
1材料与方法
1.1 仪器与试剂
1290 Infinity HpLC与6470 TQ MS/MS（安捷伦科技，美国），双极银丝记录电极（北京旭月科技有限公司），示波器（美国Tektronix oscilloscoPe公司），腺苷、cAMP和醋酸铵均购自Sigma（St. Louis， Missouri， USA），氨水购自泰坦科技股份有限公司，乙腈（色谱纯，默克公司），水为超纯去离子水（18.2 M）。
1.2 动物模型的建立
8周龄SPF级SD雄性大鼠12只，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，许可证号：SCXK（沪）2013-0016。动物饲养严格按照国家实验动物饲养和使用指南进行。适应性饲养1周后随机分成Sham组、CS组，每组6只。慢性应激高血压大鼠模型参照相关文献[3]。Sham组除不给予应激刺激外，其他条件与CS组相同。
1.3 血压测定与样本收集
血压测定参照相关文献进行[4]。测量结束后，大鼠行安乐死。断头取出RVLM区组织，-80℃冰箱保存。
1.4 色谱质谱条件
1.4.1 色谱条件
色谱柱HyPercarb Column（3 μm，2.1×100 mm，Thermo Fisher Scientific），柱温35℃。流动相15mM醋酸铵-0.3%氨水（A）-15mM醋酸铵-0.3%氨水-90%乙腈（B），Posttime 3 min。洗脱梯度：0～2 min，3%B;2～10 min，3%～50%B;10～14 min，50%～85%B，14～17 min，85%。流速0.35 ml/min，进样量1 μl。
1.4.2 质谱条件
ESI+动态MRM模式，Gas TemP 350℃，Gas Flow 10 L/min，Nebulizer 40 Psi，SheathGasHeater 350℃，SheathGasFlow 11 L/min，CaPillary 4 000 V，其他参数见表1，色谱图见图1。
1.5 标准品的配制
精密称取标准品10 mg，置于容量瓶中，加入水，配制约1 mg/ml的标准品储备液。
1.6 样品的前处理
精密称取脑组织，加入200 μl甲醇匀浆（60 Hz，60 s）后，离心15 min（12000 g，4℃），取上清液待测。
1.7 统计学方法
采用SPSS21.0对数据进行处理，P<0.05为差异具有统计学意义。
2结果
2.1 两组大鼠血压比较
经4周慢性应激之后，CS组血压显著升高（P<0.01），符合慢性应激高血压的表现。见表2。
2.2 腺苷、cAMP含量测定
2.2.1 线性方程的建立
取标准品储备液，用50%甲醇稀释，按1.4项下进行测定，以浓度为横坐标，以峰面积作为纵坐标绘制标准曲线，结果显示不同浓度腺苷、cAMP与峰面积均具有良好的线性关系，相关系数大于0.999。见表3。
2.2.2 精密度
测定低、中、高浓度腺苷、cAMP，计算精密度。腺苷精密度为0.48%～1.65%（n=6），cAMP精密度为0.96%～3.21%（n=6），说明方法精密度良好。
2.2.3 测定结果
将脑组织按照1.6项下处理，按1.4项下进行测定，结果显示CS组腺苷和cAMP的含量较Sham组显著下调（P<0.01）。见表4。
3討论
腺苷具有舒张血管、对抗室上性心动过速的作用。研究表明，腺苷与血流量大小密切相关，可通过与血管平滑肌的直接作用使血管舒张，血压下降[5]。此外，腺苷可通过腺苷受体A2介导的Gαs使cAMP发生变化[6]。在本实验中，CS组腺苷和cAMP均下调，提示慢性应激所致的高血压可能与MAPK磷酸化程度相关。
本研究通过对腺苷、cAMP的靶向检测，初步推断CS所致高血压可能与腺苷、cAMP的下调相关，并为今后研究慢性应激性高血压的病理机制提供一定参考。
参考文献
[1]Carlene ML，StePhen VH，Anthony R.Global burden of blood-Pressure-related disease， 2001[J].The Lancet，2008，371（9623）：1513-1518.
[2]Tobe SW， Kiss A， Sainsbury S，et al.The imPact of job strain and marital cohesion on ambulatory blood Pressure during 1 year： the double exPosure study[J]. Am J HyPertens，2007，20（2）：148-53.
[3]Elizalde N，García-García AL，Totterdell S，et al.Sustained stress-induced changes in mice as a model for chronic dePression[J].PsychoPharmacology （Berl），2010，210（3）：393-406.
[4]Wu Q， Xia DM， Lan F，et al.UPLC-QTOF/MS-based metabolomics reveals the mechanism of chronic unPredictable mild stress-induced hyPertension in rats[J].Biomed Chromatogr，2019，33（10）：e4619.
[5]Marshall JM.The roles of adenosine and related substances in exercise hyPeraemia[J].J Physiol，2007，583（Pt 3）：835-845.
[6]Schulte G，Fredholm BB.Signalling from adenosine recePtors to mitogen-activated Protein kinases[J].Cell Signal，2003，15（9）：813-827.