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韩军涛 朱雄翔 王洪涛
[摘要]目的：研究p27对增生性瘢痕成纤维细胞－胶原网收缩的影响差异，探讨p27在瘢痕形成中的作用。方法：取体外培养的人增生性瘢痕成纤维细胞(HTsFb)，p27基因转染HTsFb，建立成纤维细胞－胶原网模型，观察p27基因转染对p27基因转染HTsFb－胶原网收缩的影响差异。结果：p27能抑制HTsFb－胶原网收缩。结论：p27可能通过抑制瘢痕收缩来抑制瘢痕形成。
[关键词]P27；成纤维细胞胶原网；瘢痕
[中图分类号]R619．6 [文献标识码]A [文章编号]1008—6455(2007)01—0019－02
细胞周期调节蛋白在正常细胞的生长和肿瘤的发生中起着重要的调控作用。细胞周期素依赖性激酶(CDKs)是细胞周期进展的主要调节因子，CDKs能够使Rb基因及其相关蛋白磷酸化，反过来又受到细胞周期素(cyclin)的水平，磷酸化和细胞周期素依赖性激酶抑制剂(CKIs)的控制。作用CDK的抑制蛋白p27，已证明是潜在的肿瘤抑制因子或抑癌基因。p27主要是通过与cyclin E-CDK2复合物的相互作用，从而调节细胞从G1后期到S期。目前认为p27是TGF-β、cAMP及其他细胞外因子诱导细胞生长停滞的主要介质。成纤维细胞一胶原网系统是研究创面愈合与瘢痕挛缩较为先进的三维立体培养模型，我们以成纤维细胞－胶原网为模型，研究了抑癌基因p27转染对人增生性瘢痕成纤维细胞－胶原网收缩影响，探讨抑制瘢痕挛缩可能的机制，以期为瘢痕的防治提供新的途径。
1 材料和方法
1．1材料：p27-pcDNA3真核表达质粒由作者本人构建，DMEM为GIBCO公司产品，胰蛋白酶为DIBCO公司产品，新生小牛血清为上海产。
1．2方法
1．2．1成纤维细胞培养及脂质体介导的p27基因转染参照文献进行。
1．2．2鼠尾胶原的提取及定量：取wistar鼠尾2根，750ml／L乙醇浸泡20min,生理盐水漂洗3次，无菌条件下抽出尾腱，溶于1ml／L醋酸溶液500ml中。4℃下搅拌48h，取上清，紫外分光光度法定量蛋白质含量为0．2g/L，用于实验。 1．2．3成纤维细胞胶原网凝胶系统的建立取对数生长期HTsFb，调整细胞浓度为3．0×108／L，将细胞悬液，10×DMEM，11．76g/L NaHCO3，0．2g/L鼠尾胶原按2：1：2：5的比例，将四种成分快速混匀，用1mol／L NaOH及0．4mol／L NaOH调整pH值至中性，形成成纤维细胞胶原混悬液，将该混悬液移入直径33mm的培养皿中，2ml／皿，置37℃、50ml／LC02孵箱中10min，混悬液即形成凝胶，轻叩皿底，使凝胶块和皿底分离，然后每皿加入含10g/LFCS的DMEM 1mL，设置A：空白对照：B：pcDNA3：C：DcDNA3-p27三组，继续培养，以不同时间点凝胶块的面积与初始面积百分比(Percentage of Area)来表示凝胶收缩的程度。
2 结果p27对HTsFb胶原网收缩的影响
2．1细胞形态与分布：成纤维细胞胶原网(fibroblast-populated collagen lattice，FPLC)形成时呈透明状态，凝胶化以后变成不透明可被握持的凝胶块。当凝胶与培养皿分离后则凝胶块和圆盘状漂浮在培养液表面，在倒置显微镜下，可清楚地看到各个层次的细胞及其形态。成纤维细胞在凝胶中的位置相对固定，不象在普通二维培养系统中那样迅速沉淀，说明此时成纤维细胞已经粘附在胶原支架上，约4～6h后，经胰酶消化后呈圆形的成纤维细胞表面逐渐伸展延长，形成较多的胞质突起，随着时间的推移，这些突起在细胞的两极逐渐伸展延长，但数目逐渐减少，最后在细胞的两极形成两个较长的突起，使细胞大致成长梭形。伴随着凝胶块的收缩，成纤维细胞变得更加致密，有时互相交织成网状，A、B、C三组成纤维细胞的形态及排列未发现明显差异，在早期(24h)内，转染P27的C组瘢痕成纤维细胞伸展开的时间较早，且收缩速度较A，B组细胞胶原网快，C组瘢痕成纤维细胞在相同的时间点显得较为致密，但后期(＞24h)收缩速度较A，B组细胞胶原网快，C组瘢痕成纤维细胞在相同的时间点显得较为稀疏。
2．2 P27对HTsFb-胶原网收缩的影响：在快速收缩时相(24h内)，P27对瘢痕成纤维细胞胶原网收缩有明显的促进作用；而在延缓收缩相(超过24h)则对瘢痕成纤维细胞胶原网收缩有明显的抑制作用(见图1)。
3 讨论
传统的成纤维细胞体外二维培养方法，使我们能将成纤维细胞从体内错综复杂的因素中分离出来，置于一定的因素控制下，观察细胞的生物学行为，从而为创面愈合及瘢痕异常增生提供实验理论依据，但是二维培养方法忽视了细胞外基质与成纤维细胞的相互作用。近年来，很多实验证明了细胞外基质一方面维持正常的组织结构形态，另一方面与细胞相互作用、相互依存，对维持正常的细胞形态及增殖分化、合成代谢的功能非常重要。1979年Bell设计了FPCL模型，更加类似于体内环境，得到广泛应用。1995年Tsai等用增生性瘢痕和正常皮肤来源的成纤维细胞形成FPCL，发现增生性瘢痕来源的FPCL收缩快，收缩能力强。这些研究中都显示增生性瘢痕来源的可收缩的FPCL能较好地保持增生性瘢痕的特征，是较为理想的增生性瘢痕体外模型。
含成纤维细胞胶原网的收缩过程大致上可分为两个时相：①快速收缩时相：发生在收缩过程的早期，本实验主要发生在24h以内；②延缓收缩相，两收缩时相之间并无明显界限．凝胶收缩的过程受细胞组织来源及其功能状态、细胞浓度、胶原浓度、血清含量及细胞因子的含量等多种因素的影响，本实验发现在快速收缩时相(24h内)，P27对瘢痕成纤维细胞胶原网收缩有明显的促进作用；而在延缓收缩时相(超过24h)则对瘢痕成纤维细胞胶原网收缩有明显的抑制作用。
成纤维细胞胶原网收缩的机理是由于成纤维细胞产生的张力，作用于胶原纤维，使之发生重排或改构，导致固相与液相相互分离的结果，这一过程对类似于伤口收缩的过程。我们分析在快速收缩时相p27对FPLC收缩的刺激作用提示在伤口愈合早期可能通过促进成纤维细胞的收缩功能来促进创面愈合，而在伤口愈合后期可能通过抑制成纤维细胞的收缩功能来抑制瘢痕挛缩．其对成纤维胶原网的作用机制可能是多方面的，在早期可能通过调节细胞内各种生长因子的表达，改变细胞内各种张力纤维，张力蛋白如α-SM actin的表达、以及微丝微管的数量改变或排列，以及调节成纤维细胞与胶原之间的粘附、影响成纤维细胞的增殖与凋亡等多种途径来实现，具体的机制尚需进一步探讨。
编辑／张惠娟
注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。
[摘要]目的：研究p27对增生性瘢痕成纤维细胞－胶原网收缩的影响差异，探讨p27在瘢痕形成中的作用。方法：取体外培养的人增生性瘢痕成纤维细胞(HTsFb)，p27基因转染HTsFb，建立成纤维细胞－胶原网模型，观察p27基因转染对p27基因转染HTsFb－胶原网收缩的影响差异。结果：p27能抑制HTsFb－胶原网收缩。结论：p27可能通过抑制瘢痕收缩来抑制瘢痕形成。
[关键词]P27；成纤维细胞胶原网；瘢痕
[中图分类号]R619．6 [文献标识码]A [文章编号]1008—6455(2007)01—0019－02
细胞周期调节蛋白在正常细胞的生长和肿瘤的发生中起着重要的调控作用。细胞周期素依赖性激酶(CDKs)是细胞周期进展的主要调节因子，CDKs能够使Rb基因及其相关蛋白磷酸化，反过来又受到细胞周期素(cyclin)的水平，磷酸化和细胞周期素依赖性激酶抑制剂(CKIs)的控制。作用CDK的抑制蛋白p27，已证明是潜在的肿瘤抑制因子或抑癌基因。p27主要是通过与cyclin E-CDK2复合物的相互作用，从而调节细胞从G1后期到S期。目前认为p27是TGF-β、cAMP及其他细胞外因子诱导细胞生长停滞的主要介质。成纤维细胞一胶原网系统是研究创面愈合与瘢痕挛缩较为先进的三维立体培养模型，我们以成纤维细胞－胶原网为模型，研究了抑癌基因p27转染对人增生性瘢痕成纤维细胞－胶原网收缩影响，探讨抑制瘢痕挛缩可能的机制，以期为瘢痕的防治提供新的途径。
1 材料和方法
1．1材料：p27-pcDNA3真核表达质粒由作者本人构建，DMEM为GIBCO公司产品，胰蛋白酶为DIBCO公司产品，新生小牛血清为上海产。
1．2方法
1．2．1成纤维细胞培养及脂质体介导的p27基因转染参照文献进行。
1．2．2鼠尾胶原的提取及定量：取wistar鼠尾2根，750ml／L乙醇浸泡20min,生理盐水漂洗3次，无菌条件下抽出尾腱，溶于1ml／L醋酸溶液500ml中。4℃下搅拌48h，取上清，紫外分光光度法定量蛋白质含量为0．2g/L，用于实验。 1．2．3成纤维细胞胶原网凝胶系统的建立取对数生长期HTsFb，调整细胞浓度为3．0×108／L，将细胞悬液，10×DMEM，11．76g/L NaHCO3，0．2g/L鼠尾胶原按2：1：2：5的比例，将四种成分快速混匀，用1mol／L NaOH及0．4mol／L NaOH调整pH值至中性，形成成纤维细胞胶原混悬液，将该混悬液移入直径33mm的培养皿中，2ml／皿，置37℃、50ml／LC02孵箱中10min，混悬液即形成凝胶，轻叩皿底，使凝胶块和皿底分离，然后每皿加入含10g/LFCS的DMEM 1mL，设置A：空白对照：B：pcDNA3：C：DcDNA3-p27三组，继续培养，以不同时间点凝胶块的面积与初始面积百分比(Percentage of Area)来表示凝胶收缩的程度。
2 结果p27对HTsFb胶原网收缩的影响
2．1细胞形态与分布：成纤维细胞胶原网(fibroblast-populated collagen lattice，FPLC)形成时呈透明状态，凝胶化以后变成不透明可被握持的凝胶块。当凝胶与培养皿分离后则凝胶块和圆盘状漂浮在培养液表面，在倒置显微镜下，可清楚地看到各个层次的细胞及其形态。成纤维细胞在凝胶中的位置相对固定，不象在普通二维培养系统中那样迅速沉淀，说明此时成纤维细胞已经粘附在胶原支架上，约4～6h后，经胰酶消化后呈圆形的成纤维细胞表面逐渐伸展延长，形成较多的胞质突起，随着时间的推移，这些突起在细胞的两极逐渐伸展延长，但数目逐渐减少，最后在细胞的两极形成两个较长的突起，使细胞大致成长梭形。伴随着凝胶块的收缩，成纤维细胞变得更加致密，有时互相交织成网状，A、B、C三组成纤维细胞的形态及排列未发现明显差异，在早期(24h)内，转染P27的C组瘢痕成纤维细胞伸展开的时间较早，且收缩速度较A，B组细胞胶原网快，C组瘢痕成纤维细胞在相同的时间点显得较为致密，但后期(＞24h)收缩速度较A，B组细胞胶原网快，C组瘢痕成纤维细胞在相同的时间点显得较为稀疏。
2．2 P27对HTsFb-胶原网收缩的影响：在快速收缩时相(24h内)，P27对瘢痕成纤维细胞胶原网收缩有明显的促进作用；而在延缓收缩相(超过24h)则对瘢痕成纤维细胞胶原网收缩有明显的抑制作用(见图1)。
3 讨论
传统的成纤维细胞体外二维培养方法，使我们能将成纤维细胞从体内错综复杂的因素中分离出来，置于一定的因素控制下，观察细胞的生物学行为，从而为创面愈合及瘢痕异常增生提供实验理论依据，但是二维培养方法忽视了细胞外基质与成纤维细胞的相互作用。近年来，很多实验证明了细胞外基质一方面维持正常的组织结构形态，另一方面与细胞相互作用、相互依存，对维持正常的细胞形态及增殖分化、合成代谢的功能非常重要。1979年Bell设计了FPCL模型，更加类似于体内环境，得到广泛应用。1995年Tsai等用增生性瘢痕和正常皮肤来源的成纤维细胞形成FPCL，发现增生性瘢痕来源的FPCL收缩快，收缩能力强。这些研究中都显示增生性瘢痕来源的可收缩的FPCL能较好地保持增生性瘢痕的特征，是较为理想的增生性瘢痕体外模型。
含成纤维细胞胶原网的收缩过程大致上可分为两个时相：①快速收缩时相：发生在收缩过程的早期，本实验主要发生在24h以内；②延缓收缩相，两收缩时相之间并无明显界限．凝胶收缩的过程受细胞组织来源及其功能状态、细胞浓度、胶原浓度、血清含量及细胞因子的含量等多种因素的影响，本实验发现在快速收缩时相(24h内)，P27对瘢痕成纤维细胞胶原网收缩有明显的促进作用；而在延缓收缩时相(超过24h)则对瘢痕成纤维细胞胶原网收缩有明显的抑制作用。
成纤维细胞胶原网收缩的机理是由于成纤维细胞产生的张力，作用于胶原纤维，使之发生重排或改构，导致固相与液相相互分离的结果，这一过程对类似于伤口收缩的过程。我们分析在快速收缩时相p27对FPLC收缩的刺激作用提示在伤口愈合早期可能通过促进成纤维细胞的收缩功能来促进创面愈合，而在伤口愈合后期可能通过抑制成纤维细胞的收缩功能来抑制瘢痕挛缩．其对成纤维胶原网的作用机制可能是多方面的，在早期可能通过调节细胞内各种生长因子的表达，改变细胞内各种张力纤维，张力蛋白如α-SM actin的表达、以及微丝微管的数量改变或排列，以及调节成纤维细胞与胶原之间的粘附、影响成纤维细胞的增殖与凋亡等多种途径来实现，具体的机制尚需进一步探讨。
编辑／张惠娟
注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。