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摘 要 采用液-液分配法对圆滑番荔枝叶乙醇提取物进行萃取分离，得到石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯等不同萃取组分。采用生长速率法测定不同萃取组分对胡椒瘟病菌的抑制作用。结果表明：乙酸乙酯萃取组分对胡椒瘟病菌的抑制作用最强，其中20 mg/mL乙酸乙酯萃取组分对胡椒瘟病菌菌丝生长的抑制率达到74.43%，具有较好的抑菌效果。
关键词 圆滑番荔枝叶 ；萃取组分 ；胡椒瘟病菌 ；抑菌活性
分类号 S667.9 ；S435.72
Determination of the Antifungal Activity of Ethanol Extracts from
Annona glabra Leaf against Phytophthora capsici
GOU Yafeng1，2） SUN Shiwei1，2） GAO Shengfeng1，2） SANG Liwei1，2） LIU Aiqin1，2）
（1 Spice and Beverage Research Institute， CATAS， Wanning， Hainan 571533；
2 Hainan Provincial Key Laboratory of Genetic Improvement and Quality Regulation for
Tropical Spice and Beverage Crops， Wanning， Hainan 571533）
Abstract Annona glabra leaf ethanol extracts were extracted by liquid - liquid partition method. Getting different petroleum ether， trichloromethane， ethyl acetate extract components. Testing the different components antifungal activity against Phytophthora capsici with growth rate method. The results showed that the ethyl acetate extract components had high inhibition rate against Phytophthora capsici mycelium growth. When the concentration was 20 mg/mL， the inhibition rate reached to 74.43%.
Keywords Annona glabra leaf ； extract components ； Phytophthora capsici ； antifungal activity 胡椒瘟病是一种由疫霉属病原菌（Phytophthora capsici）引起的传染力很强的土传病害，常在雨季时发生[1]。胡椒瘟病是胡椒生产中灾难性病害，病害发生轻微时，可使胡椒产量损失5%-30%；感病严重的胡椒可整株萎蔫枯死，损失达90%，造成严重的经济损失[2-3]。目前国内防治胡椒瘟病主要以化学防治技术为主[4-6]。国外Kasim R研究了甲霜灵、疫霜灵等对胡椒瘟病的室内和大田防治效果[7]。由于长期使用化学农药不仅容易引起抗药性，而且容易破坏胡椒园的生态环境和降低胡椒产品品质。
圆滑番荔枝（Annona glabra Linn.）是番荔枝科番荔枝属植物。番荔枝科植物具有抗病毒、虫、抗癌等多种生理活性。早在1982年由M.Leboeuf等报道番荔枝科植物中含有各种生物碱、糖类、脂肪酸、氨基酸、蛋白质、多酚类、挥发油、帖类及各式芳香性化合物。田娟[8]、志明[9]等从圆滑番荔枝中分离得到萜烯类、生物碱等化合物，该类化合物已报道具有很强的抗癌作用。有研究报道圆滑番荔枝乙醇提取物对胡椒瘟病菌菌丝生长有较好的抑制作用[10]。因此，本实验以胡椒瘟病菌为供试病原菌，测定圆滑番荔枝叶乙醇提取物不同萃取组分对胡椒瘟病菌的抑菌活性，为进一步分离抑制胡椒瘟病菌的活性成分奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物
圆滑番荔枝（Annona glabra Linn.）采于中国热带农业科学院香料饮料研究所。将新鲜的圆滑番荔枝叶充分阴干，磨碎过40目筛后置通风、避光处储藏备用。
1.1.2 病原菌
胡椒瘟病菌（Phytophthora capsici）由中国热带农业科学院香料饮料研究所病虫害防控研究室提供。
1.2 方法
1.2.1 圆滑番荔枝提取物的制备
冷浸法：准确称取2 kg的圆滑番荔枝叶干粉装入广口瓶中，加入干粉5倍量的乙醇浸提48 h并将滤液减压浓缩，依次重复3次，合并3次的浓缩液放置4℃冰箱内备用。
1.2.2 圆滑番荔枝提取物不同萃取物的制备
液-液萃取法：准确称取圆滑番荔枝叶乙醇提取物浸膏5 g加入10倍量的蒸馏水，装入分液漏斗中混匀，依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯各萃取3次，每次50 mL。分别合并各溶剂萃取液，减压浓缩分别得圆滑番荔枝叶乙醇提取物石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯萃取组分浸膏，备用（图1）。
1.2.3 圆滑番荔枝提取物不同萃取组分对胡椒瘟病菌的影响
菌丝生长速率法：准确称取0.4 g圆滑番荔枝叶乙醇提取物不同萃取物浸膏，先用1 mL无水乙醇助溶，再用无菌蒸馏水定容至20 mL，制成20 mg/mL的萃取物母液。采用倍半稀释法用无菌蒸馏水稀释，依次制成浓度为10、5、2.5、1.25 mg/mL药液。然后将培养基融化并冷却至50℃左右时，把1 mL不同浓度的圆滑番荔枝萃取组分分别与9 mL/皿的PDA培养基混合，摇匀待其凝固后，取菌落直径为6 mm、培养好的胡椒瘟病菌的外层菌块放置于培养皿中央，以加入等体积萃取溶剂灭菌水的PDA培养平板为对照，每个处理做3个皿重复。接种后，在人工气候培养箱（25～28℃）下培养5 d后，采用十字交叉法分别测量菌落直径，求其平均值，按下式计算抑菌率。 2 结果与分析
2.1 圆滑番荔枝叶提取率
供试植物采用冷浸提的方法提取，并减压浓缩至浸膏，得圆滑番荔枝叶提取率为17.15%。
2.2 圆滑番荔枝叶提取物不同萃取组分对胡椒瘟病菌活性测定
圆滑番荔枝叶乙醇提取物不同溶剂萃取组分分别用倍半稀释法配成5个梯度浓度（20、10、5、2.5、1.25 mg/mL），对胡椒瘟病菌进行抑菌活性测定，测定结果见图2。
从图2中可以看出，在供试浓度下，乙酸乙酯萃取组分对胡椒瘟病菌的抑菌率均高于石油醚和三氯甲烷萃取组分。当供试浓度为20 mg/mL，石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯萃取组分的抑菌率分别为34.63%、44.93%和74.43%。其中乙酸乙酯萃取组分的抑菌率最高，达到74.43%，具有较好的抑菌效果。
3 讨论与结果
从植物中寻找新型、具抑菌活性的天然化合物，并对其进行适当的结构修饰，以筛选出活性更高的新化合物，是当前植物源杀菌剂研究的重点。从以上的结果可以得出，石油醚、三氯甲烷和乙酸乙酯萃取圆滑番荔枝叶乙醇提取物各组分对胡椒瘟病菌的抑菌活性具有较大差异。当供试浓度为20 mg/mL，石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯萃取组分的抑菌率分别为34.63%、44.93%和74.43%。其中乙酸乙酯萃取组分对胡椒瘟病菌菌丝生长的抑制作用最高，达到74.43%。由此可见，从圆滑番荔枝叶乙醇提取物乙酸乙酯萃取组分中分离对胡椒瘟病菌具有抑菌作用的活性成分具有广阔前景，为进一步研发高效、低毒、环境友好型的植物源杀菌剂奠定了基础，对胡椒安全生产和胡椒产业的发展具有一定促进作用。
参考文献
[1] 桑利伟，谭乐和，刘爱勤，等. 海南省胡椒主要病害现状初步调查[J]. 植物保护，2010，36（5）：133-138.
[2] 桑利伟，刘爱勤，谭乐和，等. 胡椒瘟病田间发生规律观察[J]. 热带作物学报，2010，31（11）：1 996-1 999.
[3] 崔昌华，郑服丛，贺春萍，等. 海南胡椒主要真菌病害调查与病原鉴定[J]. 安徽农业科学，2011，39（6）：3 355-3 358.
[4] 刘进平，郑成木. 胡椒瘟病与辣椒疫霉[J]. 热带农业科学， 2001（5）：27-31.
[5] 邢谷杨. 胡椒无公害生产及其主要病虫害防治[J]. 广西热带农业， 2004（6）：34-35.
[6] 黄家峰. 胡椒瘟病的观察及其防治[J]. 热带农业科学，1986（2）：44-45.
[7] Kasim R. The control of foot rot disease of pepper caused by Phytophthora palmivora using fungicides[J]. Edisi Khusus Penelitian Tanaman Rempah dan Obat， 1986， 11（2）： 63-66.
[8] 田丽娟，杨念云，孟正木，等. 圆滑番荔枝的化学成分研究[J]. 中国药学杂志，2003，38（4）：258-260.
[9] 毕志明，蒯玉花，李 萍，等. 圆滑番荔枝树皮中的化学成分[J]. 江苏：药学与临床研究，2006，14（1）：38-39.
[10] 苟亚峰，刘爱勤，孙世伟，等. 23种植物提取物对胡椒瘟病病原菌的抑制作用[J]. 2010，36（6）：128-131.
关键词 圆滑番荔枝叶 ；萃取组分 ；胡椒瘟病菌 ；抑菌活性
分类号 S667.9 ；S435.72
Determination of the Antifungal Activity of Ethanol Extracts from
Annona glabra Leaf against Phytophthora capsici
GOU Yafeng1，2） SUN Shiwei1，2） GAO Shengfeng1，2） SANG Liwei1，2） LIU Aiqin1，2）
（1 Spice and Beverage Research Institute， CATAS， Wanning， Hainan 571533；
2 Hainan Provincial Key Laboratory of Genetic Improvement and Quality Regulation for
Tropical Spice and Beverage Crops， Wanning， Hainan 571533）
Abstract Annona glabra leaf ethanol extracts were extracted by liquid - liquid partition method. Getting different petroleum ether， trichloromethane， ethyl acetate extract components. Testing the different components antifungal activity against Phytophthora capsici with growth rate method. The results showed that the ethyl acetate extract components had high inhibition rate against Phytophthora capsici mycelium growth. When the concentration was 20 mg/mL， the inhibition rate reached to 74.43%.
Keywords Annona glabra leaf ； extract components ； Phytophthora capsici ； antifungal activity 胡椒瘟病是一种由疫霉属病原菌（Phytophthora capsici）引起的传染力很强的土传病害，常在雨季时发生[1]。胡椒瘟病是胡椒生产中灾难性病害，病害发生轻微时，可使胡椒产量损失5%-30%；感病严重的胡椒可整株萎蔫枯死，损失达90%，造成严重的经济损失[2-3]。目前国内防治胡椒瘟病主要以化学防治技术为主[4-6]。国外Kasim R研究了甲霜灵、疫霜灵等对胡椒瘟病的室内和大田防治效果[7]。由于长期使用化学农药不仅容易引起抗药性，而且容易破坏胡椒园的生态环境和降低胡椒产品品质。
圆滑番荔枝（Annona glabra Linn.）是番荔枝科番荔枝属植物。番荔枝科植物具有抗病毒、虫、抗癌等多种生理活性。早在1982年由M.Leboeuf等报道番荔枝科植物中含有各种生物碱、糖类、脂肪酸、氨基酸、蛋白质、多酚类、挥发油、帖类及各式芳香性化合物。田娟[8]、志明[9]等从圆滑番荔枝中分离得到萜烯类、生物碱等化合物，该类化合物已报道具有很强的抗癌作用。有研究报道圆滑番荔枝乙醇提取物对胡椒瘟病菌菌丝生长有较好的抑制作用[10]。因此，本实验以胡椒瘟病菌为供试病原菌，测定圆滑番荔枝叶乙醇提取物不同萃取组分对胡椒瘟病菌的抑菌活性，为进一步分离抑制胡椒瘟病菌的活性成分奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物
圆滑番荔枝（Annona glabra Linn.）采于中国热带农业科学院香料饮料研究所。将新鲜的圆滑番荔枝叶充分阴干，磨碎过40目筛后置通风、避光处储藏备用。
1.1.2 病原菌
胡椒瘟病菌（Phytophthora capsici）由中国热带农业科学院香料饮料研究所病虫害防控研究室提供。
1.2 方法
1.2.1 圆滑番荔枝提取物的制备
冷浸法：准确称取2 kg的圆滑番荔枝叶干粉装入广口瓶中，加入干粉5倍量的乙醇浸提48 h并将滤液减压浓缩，依次重复3次，合并3次的浓缩液放置4℃冰箱内备用。
1.2.2 圆滑番荔枝提取物不同萃取物的制备
液-液萃取法：准确称取圆滑番荔枝叶乙醇提取物浸膏5 g加入10倍量的蒸馏水，装入分液漏斗中混匀，依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯各萃取3次，每次50 mL。分别合并各溶剂萃取液，减压浓缩分别得圆滑番荔枝叶乙醇提取物石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯萃取组分浸膏，备用（图1）。
1.2.3 圆滑番荔枝提取物不同萃取组分对胡椒瘟病菌的影响
菌丝生长速率法：准确称取0.4 g圆滑番荔枝叶乙醇提取物不同萃取物浸膏，先用1 mL无水乙醇助溶，再用无菌蒸馏水定容至20 mL，制成20 mg/mL的萃取物母液。采用倍半稀释法用无菌蒸馏水稀释，依次制成浓度为10、5、2.5、1.25 mg/mL药液。然后将培养基融化并冷却至50℃左右时，把1 mL不同浓度的圆滑番荔枝萃取组分分别与9 mL/皿的PDA培养基混合，摇匀待其凝固后，取菌落直径为6 mm、培养好的胡椒瘟病菌的外层菌块放置于培养皿中央，以加入等体积萃取溶剂灭菌水的PDA培养平板为对照，每个处理做3个皿重复。接种后，在人工气候培养箱（25～28℃）下培养5 d后，采用十字交叉法分别测量菌落直径，求其平均值，按下式计算抑菌率。 2 结果与分析
2.1 圆滑番荔枝叶提取率
供试植物采用冷浸提的方法提取，并减压浓缩至浸膏，得圆滑番荔枝叶提取率为17.15%。
2.2 圆滑番荔枝叶提取物不同萃取组分对胡椒瘟病菌活性测定
圆滑番荔枝叶乙醇提取物不同溶剂萃取组分分别用倍半稀释法配成5个梯度浓度（20、10、5、2.5、1.25 mg/mL），对胡椒瘟病菌进行抑菌活性测定，测定结果见图2。
从图2中可以看出，在供试浓度下，乙酸乙酯萃取组分对胡椒瘟病菌的抑菌率均高于石油醚和三氯甲烷萃取组分。当供试浓度为20 mg/mL，石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯萃取组分的抑菌率分别为34.63%、44.93%和74.43%。其中乙酸乙酯萃取组分的抑菌率最高，达到74.43%，具有较好的抑菌效果。
3 讨论与结果
从植物中寻找新型、具抑菌活性的天然化合物，并对其进行适当的结构修饰，以筛选出活性更高的新化合物，是当前植物源杀菌剂研究的重点。从以上的结果可以得出，石油醚、三氯甲烷和乙酸乙酯萃取圆滑番荔枝叶乙醇提取物各组分对胡椒瘟病菌的抑菌活性具有较大差异。当供试浓度为20 mg/mL，石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯萃取组分的抑菌率分别为34.63%、44.93%和74.43%。其中乙酸乙酯萃取组分对胡椒瘟病菌菌丝生长的抑制作用最高，达到74.43%。由此可见，从圆滑番荔枝叶乙醇提取物乙酸乙酯萃取组分中分离对胡椒瘟病菌具有抑菌作用的活性成分具有广阔前景，为进一步研发高效、低毒、环境友好型的植物源杀菌剂奠定了基础，对胡椒安全生产和胡椒产业的发展具有一定促进作用。
参考文献
[1] 桑利伟，谭乐和，刘爱勤，等. 海南省胡椒主要病害现状初步调查[J]. 植物保护，2010，36（5）：133-138.
[2] 桑利伟，刘爱勤，谭乐和，等. 胡椒瘟病田间发生规律观察[J]. 热带作物学报，2010，31（11）：1 996-1 999.
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[10] 苟亚峰，刘爱勤，孙世伟，等. 23种植物提取物对胡椒瘟病病原菌的抑制作用[J]. 2010，36（6）：128-131.