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从DNA双螺旋结构的发现开始，生命科学研究进入分子水平，在1970年代出现的测序技术为破译遗传密码作出了巨大贡献。近几年出现的单分子测序技术，可以在单个分子水平读取核苷酸序列，也被称为第三代测序技术，主要代表有HeliScope、Nanopore和PacBio等。与传统的第一代和第二代测序技术相比，第三代测序能够产生更长的碱基读长，能直接对RNA进行测序，无需逆转录，测序速度极快，同时其中某些技术所涉及的设备可以小型化，可便携至野外现场测序。第三代测序技术在生命科学基础理论研究，及生物医学临床实践中，具有巨大应用，本文重点介绍了各种单分子测序技术的原理、优缺点，及其应用研究进展。