【摘 要】
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目的 克隆大鼠ERp57基因、原核表达蛋白并进行纯化,最终在大鼠精子和卵细胞中进行鉴定及定位.方法 运用RT-PCR从SD大鼠睾丸组织的总RNA中克隆大鼠ERp57 cDNA,构建ERp57原核表
【机 构】
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上海交通大学医学院组织胚胎学教研室
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目的 克隆大鼠ERp57基因、原核表达蛋白并进行纯化,最终在大鼠精子和卵细胞中进行鉴定及定位.方法 运用RT-PCR从SD大鼠睾丸组织的总RNA中克隆大鼠ERp57 cDNA,构建ERp57原核表达质粒[pET-28a(+)/ERp57]并转化E.coli的BL21菌株,IPTG诱导蛋白表达,经Ni-NTA树脂亲和层析得到纯化的ERp57蛋白.随后,通过SDS-PAGE、Western blot和酶联免疫吸附等实验对重组蛋白进行鉴定,并利用获得的蛋白免疫家兔制备多抗.最后,利用Western blot和间接免疫荧光定位的方法研究ERp57在精子和卵细胞中的定性和定位.结果 成功获得纯化后重组的大鼠ERp57蛋白,并证实大鼠成熟精子和卵细胞都存在ERp57蛋白.ERp57主要定位于附睾尾部精子头的内侧,项体反应后定位于精子头的赤道区:卵母细胞则定位在细胞表面.结论 通过对大鼠ERp57基因的原核表达和抗体的制备可为后续进一步研究该蛋白在受精过程中作用奠定实验基础,而ERp57在精卵细胞中鉴定和定位的结果表明它可能与精卵融合过程相关.
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