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摘 要：6-氨基青霉烷酸为白色或微黄色结晶粉末，用于制备半合成青霉素的原料。本文采用高校液相测定了6-氨基青霉烷酸中青霉素G的含量，固定相为：苯基柱，乙腈∶pH3.5磷酸盐缓冲溶液∶水（15∶10∶75）为流动相，检测波长为220nm，流速1.3mL·min-1，柱温：30℃。青霉素G在0.01～0.32mg·mL-1范围内呈良好的线性关系。青霉素G的平均回收率为99.2%，RSD为0.53%（n=6）；此方法简便、准确、重现性好，可用于6-氨基青霉烷酸中青霉素G的含量测定。
关键词：6-氨基青霉烷酸；青霉素G；含量
6-氨基青霉烷酸，英文名称为6-Aminopenicillanic acid，为白色或微黄色结晶粉末，微溶于水，不溶于乙酸丁酯、乙醇或丙酮。青霉素G对溶血性链球菌、肺炎球菌、草绿、色链球菌、不产酶金葡菌、白喉杆菌、炭疽杆菌等、脑膜炎球菌、淋球菌等、百日咳杆菌、产气荚膜杆菌、破伤风杆菌、难辨梭菌、乳酸杆菌等具有抗菌作用。青霉素类抗生素的毒性很小，但其青霉素类抗生素常见的过敏反应在各种药物中居首位，表现皮疹、呼吸困难、发绀、血管性水肿、血压下降、昏迷、肢体强直等。6-氨基青霉烷酸用于制备半合成青霉素的原料。国内6-APA的生产一般采用裂解工艺，因此反应中剩余原料青霉素G成为6-APA产品中的主要杂质。本文采用高校液相测定了6-氨基青霉烷酸中青霉素G的含量。
1 仪器与试药
ELGA PURELAB Ultra实验室超纯水系统（天津市劳尔科技有限公司）；QUINTIX224电子天平（锡楼兰仪器系统有限公司）；VIS-7220N可见分光光度计（北京北分瑞利分析仪器（集团）公司）；SY-8100高效液相色谱仪（北京北分瑞利分析仪器（集团）公司）；ULABO实验室温度控制器（优莱博技术（北京）有限公司）；标准型电化学PH计（上海衡电实业有限公司）；超声波清洗器US-6M（中科仪（北京）仪器有限公司）；HH-601超级恒温水浴（江苏金坛市亿通电子有限公司）。青霉素G对照品由中国药品生物制品检定所提供。磷酸（上海天普分析仪器有限公司）、冰醋酸（北京市津同乐泰化工产品有限公司）、乙腈（济宁汇德化工有限公司）、三乙胺（北京市津同乐泰化工产品有限公司）、甲醇（武汉市伟琪博星生物科技有限公司）、磷酸二氢铵（济宁汇德化工有限公司）。
2 含量测定
2.1 色谱条件：色谱柱为苯基柱；乙腈∶pH3.5磷酸盐缓冲溶液∶水（15∶10∶75）为流动相；检测波长为220nm[1-5]。理论板数按青霉素G峰计算应不得低于2000。
2.2 供试品溶液的制备
取6-氨基青霉烷酸，精密称取，精密加入流动相30mL，超声提取30分钟，放冷，过滤，滤液转移至50毫升容量瓶内用流动相定容，摇匀，即得。
2.3 对照品溶液的制备
精密称取青霉素G对照品约5mg，用流动相溶解并稀释成每1ml中含0.02mg的溶液，作为对照溶液。
2.4 阴性溶液的制备
依照处方取6-氨基青霉烷酸，照供试品溶液的制备方法制成阴性液，依上述方法测定，结果在青霉素G出峰处阴性液无色谱峰，结果阴性试验没有干扰，表明本方法专属性良好。
2.5 准曲线的制备
制备浓度为0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32mg·mL-1的对照品溶液，分别精密吸取10μL注入HPLC，记录色谱图。以峰面积积分值A（μg）为横坐标，进样量为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。试验表明，青霉素G对照品在0.01～0.32mg·mL-1范围内线性关系良好。
2.6 精密度试验
依照2.4项下制备对照品溶液，精密吸取青霉素G对照品溶液10μL重复进样6次，测定峰面积积分值，对照品峰面积积分值的RSD为0.53%。结果表明，本实验精密度良好。
2.7 重现性试验
分别称取同批6-氨基青霉烷酸样品6份，按测定方法项下的方法制备供试品溶液，测定含量，并计算样品的RSD值，结果RSD为0.65%，结果表明，此含量测定方法的重现性良好。
2.8 稳定性试验
依照2.3项下供试品制备方法制备供试品溶液，分别在0，2，4，6小时精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，进样测定，供试品青霉素G峰面积积分值的RSD为0.61%。结果表明青霉素G至少在6小时内稳定。
2.9 回收率试验
采用加样回收试验，取已知含量的同一批供试品各6份，精密称定，分精密添加一定量的青霉素G对照品，按供试品制备所述方法制备供试品溶液，测定含量（同时测定样品含量），计算回收率。6次测定的平均回收率为99.2%，RSD为0.53%。
2.10 样品含量测定
依照上述含量测定方法，测定6-氨基青霉烷酸三批样品中青霉素G的含量，含量为0.32%、0.41%、0.39%。
3 讨论
6-氨基青霉烷酸用于制备半合成青霉素的原料。国内6-APA的生产一般采用裂解工艺，因此反应中剩余原料青霉素G成为6-APA产品中的主要杂质。本实验对6-氨基青霉烷酸中青霉素G含量进行检测，有助于对青霉素G残留进行控制。实验还分别考察乙腈∶pH3.5磷酸盐缓冲溶液∶水（15∶10∶75），水-乙腈-三乙胺（80∶20：0.01），0.2mol/L磷酸二氢钾（pH=3.5）-甲醇溶液（40∶60），乙腈∶pH3.5磷酸盐缓冲溶液∶水（25∶10∶65），乙腈-甲醇-0.02mol/L乙酸钠缓冲液（40∶30∶30），乙腈-甲醇-0.02mol/L乙酸钠缓冲液（40∶30∶30），水-甲醇-三乙胺（50∶50：0.01）不同比例的流动相，结果以乙腈∶pH3.5磷酸盐缓冲溶液∶水（15∶10∶75）为流动相，供试品各峰分离效果最好，故选用乙腈∶pH3.5磷酸盐缓冲溶液∶水（15∶10∶75）为流动相。此方法简便、准确、重现性好，可用于6-氨基青霉烷酸中青霉素G的含量测定。
参考文献
[1]林小莉，张巍，董艳峰.高效液相色谱法测定青霉素钠含量的测量不确定度评定[J].中国兽药杂志，2009（4）.
[2]吕元元，任钟旗，张卫东，李群生.高效液相色谱法测定青霉素G的方法改进[J].中国药业，2008（13）.
[3]赵国芬，尹翠英，王洪涛.6-APA中残余苯乙酸、青霉素G含量的测定[J].石家庄职业技术学院学报，2008（4）.
[4]刘莎，唐政洁.高效液相色谱法测定青霉素菌丝体中青霉素的残留[J].黑龙江科技信息，2011（6）.
[5]邓斌，邓春来，张曦.高效液相色谱法检测牛奶中青霉素残留的研究进展[J].中国兽药杂志，2003（6）.
关键词：6-氨基青霉烷酸；青霉素G；含量
6-氨基青霉烷酸，英文名称为6-Aminopenicillanic acid，为白色或微黄色结晶粉末，微溶于水，不溶于乙酸丁酯、乙醇或丙酮。青霉素G对溶血性链球菌、肺炎球菌、草绿、色链球菌、不产酶金葡菌、白喉杆菌、炭疽杆菌等、脑膜炎球菌、淋球菌等、百日咳杆菌、产气荚膜杆菌、破伤风杆菌、难辨梭菌、乳酸杆菌等具有抗菌作用。青霉素类抗生素的毒性很小，但其青霉素类抗生素常见的过敏反应在各种药物中居首位，表现皮疹、呼吸困难、发绀、血管性水肿、血压下降、昏迷、肢体强直等。6-氨基青霉烷酸用于制备半合成青霉素的原料。国内6-APA的生产一般采用裂解工艺，因此反应中剩余原料青霉素G成为6-APA产品中的主要杂质。本文采用高校液相测定了6-氨基青霉烷酸中青霉素G的含量。
1 仪器与试药
ELGA PURELAB Ultra实验室超纯水系统（天津市劳尔科技有限公司）；QUINTIX224电子天平（锡楼兰仪器系统有限公司）；VIS-7220N可见分光光度计（北京北分瑞利分析仪器（集团）公司）；SY-8100高效液相色谱仪（北京北分瑞利分析仪器（集团）公司）；ULABO实验室温度控制器（优莱博技术（北京）有限公司）；标准型电化学PH计（上海衡电实业有限公司）；超声波清洗器US-6M（中科仪（北京）仪器有限公司）；HH-601超级恒温水浴（江苏金坛市亿通电子有限公司）。青霉素G对照品由中国药品生物制品检定所提供。磷酸（上海天普分析仪器有限公司）、冰醋酸（北京市津同乐泰化工产品有限公司）、乙腈（济宁汇德化工有限公司）、三乙胺（北京市津同乐泰化工产品有限公司）、甲醇（武汉市伟琪博星生物科技有限公司）、磷酸二氢铵（济宁汇德化工有限公司）。
2 含量测定
2.1 色谱条件：色谱柱为苯基柱；乙腈∶pH3.5磷酸盐缓冲溶液∶水（15∶10∶75）为流动相；检测波长为220nm[1-5]。理论板数按青霉素G峰计算应不得低于2000。
2.2 供试品溶液的制备
取6-氨基青霉烷酸，精密称取，精密加入流动相30mL，超声提取30分钟，放冷，过滤，滤液转移至50毫升容量瓶内用流动相定容，摇匀，即得。
2.3 对照品溶液的制备
精密称取青霉素G对照品约5mg，用流动相溶解并稀释成每1ml中含0.02mg的溶液，作为对照溶液。
2.4 阴性溶液的制备
依照处方取6-氨基青霉烷酸，照供试品溶液的制备方法制成阴性液，依上述方法测定，结果在青霉素G出峰处阴性液无色谱峰，结果阴性试验没有干扰，表明本方法专属性良好。
2.5 准曲线的制备
制备浓度为0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32mg·mL-1的对照品溶液，分别精密吸取10μL注入HPLC，记录色谱图。以峰面积积分值A（μg）为横坐标，进样量为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。试验表明，青霉素G对照品在0.01～0.32mg·mL-1范围内线性关系良好。
2.6 精密度试验
依照2.4项下制备对照品溶液，精密吸取青霉素G对照品溶液10μL重复进样6次，测定峰面积积分值，对照品峰面积积分值的RSD为0.53%。结果表明，本实验精密度良好。
2.7 重现性试验
分别称取同批6-氨基青霉烷酸样品6份，按测定方法项下的方法制备供试品溶液，测定含量，并计算样品的RSD值，结果RSD为0.65%，结果表明，此含量测定方法的重现性良好。
2.8 稳定性试验
依照2.3项下供试品制备方法制备供试品溶液，分别在0，2，4，6小时精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，进样测定，供试品青霉素G峰面积积分值的RSD为0.61%。结果表明青霉素G至少在6小时内稳定。
2.9 回收率试验
采用加样回收试验，取已知含量的同一批供试品各6份，精密称定，分精密添加一定量的青霉素G对照品，按供试品制备所述方法制备供试品溶液，测定含量（同时测定样品含量），计算回收率。6次测定的平均回收率为99.2%，RSD为0.53%。
2.10 样品含量测定
依照上述含量测定方法，测定6-氨基青霉烷酸三批样品中青霉素G的含量，含量为0.32%、0.41%、0.39%。
3 讨论
6-氨基青霉烷酸用于制备半合成青霉素的原料。国内6-APA的生产一般采用裂解工艺，因此反应中剩余原料青霉素G成为6-APA产品中的主要杂质。本实验对6-氨基青霉烷酸中青霉素G含量进行检测，有助于对青霉素G残留进行控制。实验还分别考察乙腈∶pH3.5磷酸盐缓冲溶液∶水（15∶10∶75），水-乙腈-三乙胺（80∶20：0.01），0.2mol/L磷酸二氢钾（pH=3.5）-甲醇溶液（40∶60），乙腈∶pH3.5磷酸盐缓冲溶液∶水（25∶10∶65），乙腈-甲醇-0.02mol/L乙酸钠缓冲液（40∶30∶30），乙腈-甲醇-0.02mol/L乙酸钠缓冲液（40∶30∶30），水-甲醇-三乙胺（50∶50：0.01）不同比例的流动相，结果以乙腈∶pH3.5磷酸盐缓冲溶液∶水（15∶10∶75）为流动相，供试品各峰分离效果最好，故选用乙腈∶pH3.5磷酸盐缓冲溶液∶水（15∶10∶75）为流动相。此方法简便、准确、重现性好，可用于6-氨基青霉烷酸中青霉素G的含量测定。
参考文献
[1]林小莉，张巍，董艳峰.高效液相色谱法测定青霉素钠含量的测量不确定度评定[J].中国兽药杂志，2009（4）.
[2]吕元元，任钟旗，张卫东，李群生.高效液相色谱法测定青霉素G的方法改进[J].中国药业，2008（13）.
[3]赵国芬，尹翠英，王洪涛.6-APA中残余苯乙酸、青霉素G含量的测定[J].石家庄职业技术学院学报，2008（4）.
[4]刘莎，唐政洁.高效液相色谱法测定青霉素菌丝体中青霉素的残留[J].黑龙江科技信息，2011（6）.
[5]邓斌，邓春来，张曦.高效液相色谱法检测牛奶中青霉素残留的研究进展[J].中国兽药杂志，2003（6）.