论文部分内容阅读
【摘要】目的：探讨人参-黄芪对衰老大鼠模型肠道微生态的影响，探寻二者联合使用对肠道微生态的影响及抗衰老机理研究。方法：模型组和人参-黄芪组大鼠皮下注射给予 D-氨基半乳糖制作衰老模型， 人参-黄芪组同时每日腹腔注射200 mg/kg 黄芪多糖及40 mg/kg 人参总皂苷持续8周，显微镜下观察小肠黏膜的形态，检测肠道iNOS、zo-1、occludin、claudin-1蛋白表达变化。结果：大鼠经衰老诱导后，小肠绒毛表面细胞凋亡较为明显，小肠iNOS、occludin、claudin-1表达显著升高，zo-1表达显著降低；而经过人参与黄芪处理后，显著抑制了大鼠小肠绒毛表面细胞的凋亡，同时抑制iNOS、occludin、claudin-1的表达，升高zo-1表达。结论：人参-黄芪联合应用可影响肠道菌群变化进而发挥抗衰老作用。
【关键词】人参；黄芪；抗衰老；肠道菌群
【中图分类号】R951 【文献标识码】A 【文章编号】2096-5249（2021）08-0006-02
衰老是一种自然的生命现象，以机体各部分组织和器官的功能活动逐渐衰退为特征。中医延年学说对人体衰老或早衰的认识源远流长，以气血津液学说最为经典，气为生命之源，“衰老”在中医中谓“气虚”，即元气不足，脏腑机能逐渐减退的虚弱症候，临床常用补益剂延年益寿[1]。现代研究认为，衰老是一个内外多种因素（基因、环境和精神心理等）共同作用的综合结果[2]，可由多种应激因素引起，如氧化应激、线粒体功能障碍等。近年来，研究发现，肠道微生物变化会导致机体免疫功能衰退，同时导致衰老相关的慢性疾病，提示肠道微生物可能对衰老产生重要作用[3]。课题组前提研究提示人参-黄芪具有调节肠道微生态功能，故本研究旨在探讨人参-黄芪对衰老大鼠模型肠道微生态的影响，探寻二者联合使用对肠道微生态的影响及抗衰老机理研究，为中医药抗衰老提供理论依据及实验数据。
1 材料与方法
1.1 实验动物
3月龄SPF级SD雄性大鼠30只由实验动物中心提供，体重分别为300～350 g/只。30只大鼠分为5组：对照组、模型组、人参组、黄芪组和人参黄芪组，大鼠在实验动物中心SPF环境下适应性喂养1周后用于试验研究，室温20～25℃，湿度40 %～60 %，定期紫外线灯消毒。
在模型组、人参组、黄芪组和人参黄芪组大鼠后肢外侧皮下部位连续注射D-半乳糖，注射剂量为0.125 g/kg·d，注射时间为每天上午9∶00～13∶00，连续注射40 d。
30只大鼠均在自由摄食、饮水，标准条件下饲养40 d。
1.2 干预方式
每日腹腔注射给予黄芪组大鼠200 mg/kg黄芪多糖，人参组大鼠40 mg/kg 人参总皂苷， 人参黄芪组大鼠200 mg/kg黄芪多糖及40 mg/kg 人参总皂苷， 同时给予对照组和衰老组大鼠等量生理盐水，连续注射8周。
1.3 观察指标
1.3.1 大鼠小肠形态：研究期间观察大鼠小肠形态变化。
1.3.2 大鼠肠道iNOS、zo-1、occludin、claudin-1蛋白表达检测：取体积100 mg冻存组织，以RIPA裂解液提取组织总蛋白，蛋白经纯化后进行定量，进行SDS-PAGE電泳，PAGE胶经硝酸纤维膜转膜后，分别孵育兔抗鼠iNOS、zo-1、occludin、claudin-1以及GAPDH一抗。再以HRP标记的二抗孵育过夜。硝酸纤维膜经定影、显影后，以Quantity One v4.4.0软件分析iNOS、zo-1、occludin、claudin-1以及GAPDH蛋白条带的光密度。
2 结果
2.1 人参-黄芪处理对衰老大鼠小肠形态的影响
如图1所示，与对照组大鼠相比较，大鼠经衰老诱导后，小肠绒毛表面细胞凋亡较为明显。而经过人参与黄芪处理后，显著抑制了大鼠小肠绒毛表面细胞的凋亡（人参组和黄芪组未观察小肠形态）。
2.2 人参和黄芪处理对衰老大鼠肠道iNOS、zo-1、occludin、claudin-1蛋白表达的影响
如图2所示，与对照组大鼠相比较，大鼠经衰老诱导后，小肠iNOS、occludin、claudin-1表达显著升高，但经过人参与黄芪分别处理后，iNOS、occludin、claudin-1的表达显著得到抑制。此外，与对照组大鼠相比较小肠zo-1表达显著降低，但经过人参与黄芪处理后，zo-1的表达显著得到提高。
3 讨论
随着人口老龄化进程的加剧，人们日益关注衰老问题及衰老所导致的疾病。研究显示，肠道微生物与机体发育和衰老密切相关，肠道菌群也叫“第二基因组”[4]。随着机体衰老，肠道微生物多样性减少，尤其是有益菌群锐减，导致许多衰老相关疾病，如免疫相关疾病、糖尿病等代谢疾病、神经退行性疾病等严重影响健康和生活质量。
《神农本草经》中记载：“人参主补五脏，安精神，定魂魄，止惊悸，除邪气，明目开心益智，久服轻身延年。”人参茎叶中提取的人参皂苷（Rb1、Rb2、Rc、Rg1、Rg2等）能不同程度的清除氧自由基，其中Rb1和Rg1被证实作用最强[5]。黄芪最早见于《五十二病方》，有“补气”之功，其活性成分黄芪甲苷[6]具有抗衰老、抗炎、免疫调节、抗氧化、抗纤维化等作用[7]。
本研究在衰老大鼠模型上证实了衰老诱导后，小肠绒毛表面细胞凋亡较为明显，小肠iNOS、occludin、claudin-1表达显著升高，zo-1表达显著降低；而经过人参与黄芪处理后，显著抑制了大鼠小肠绒毛表面细胞的凋亡，同时抑制iNOS、occludin、claudin-1的表达，升高zo-1表达；表明人参-黄芪联合应用可通过影响肠道菌群变化进而发挥抗衰老作用。衰老是人体必须经历的过程，从整体看，衰老代表健康的器官功能退化，但在细胞层面衰老也代表了细胞的功能减退和衰老凋亡的进程[8]。衰老发生的机制复杂多样，其中被广泛认可的假说是衰老受遗传因素、饮食习惯和运动等多种因素的影响，在炎症和氧化应激等多种机制的作用下引起细胞衰老等生理过程，进而导致机体各系统功能逐步退化[9]。而肠道微生物变化可以改变肠道屏障功能，破坏肠道屏障完整性，为后续的炎症和感染提供条件[10]。与此同时，肠道菌群失调，尤其是吲哚丙酸代谢相关菌群减少破坏肠道抗氧化功能；双歧杆菌和拟杆菌减少能够减少抗炎因子IL-10的含量，上调TNF-α和IL-17的含量[11]。以上均表明肠道微生物变化与衰老密切相关。而本研究通过实验已经证实，人参-黄芪联合作用能明显改善肠道微生物的紊乱，起到抗衰老的作用，为抗衰老机制的探索及临床上相关疾病的诊治提供有力证据和作用靶点，值得继续深入研究和应用推广。 参考文献
[1] 周玉，赵燕，马晖，等.中医药抗衰老作用机制研究进展[J].亚太传统医药，2016，12 （17）：50-52.
[2] Choi SH，Kim HJ，Cho HJ，et al.Gintonin-mediated release of astrocytic vascular endothelial growth factor protects cortical astrocytes from hypoxia-induced cell damages[J].J Ginseng Res，2019，43（2）：305-311.
[3] 李思慧，吳巧凤.肠道菌群对Th17/Treg免疫平衡和炎症性肠病影响的研究进展[J].免疫学杂志，2019，35（8）：722-726.
[4] 马明.人体肠道微生物组学与大健康产业[J].科学（上海），2018，70（6）：23-28，69.
[5] 周峰，李佳琪，周玉枝，等.肠道微生物与衰老[J].中国药学杂志，2019，54（10）：761-765.
[5] Kang S，Min H.Ginseng， the ’Immunity Boost’： The Effects of Panax ginseng on Immune System[J].J Ginseng Res.2012，36（4）：354-368.
[6] 朱嘉欢，黄小平，邓常清.黄芪和当归的主要活性成分配伍促进衰老造血干细胞增殖作用的研究[J].中草药，2019，50（1）：111-119.
[7] 苗雨丹，张浩，许妍妍.黄芪多糖对致衰老模型小鼠氧自由基水平的影响[J].中国老年学杂志，2017，37（17）：4193-4194.
[8] Ron，Sender，Shai，et al.Are We Really Vastly Outnumbered Revisiting the Ratio of Bacterial to Host Cells in Humans[J].Cell，2016，164（3）：337-340.
[9] Hwangbo DS，Lee HY，Abozaid LS，et al. Mechanisms of Lifespan Regulation by Calorie Restriction and Intermittent Fasting in Model Organisms[J].Nutrients，2020，12（4）：1194.
[10] Berry D，Stecher B，Schintlmeister A ，et al.Host-compound foraging by intestinal microbiota revealed by single-cell stable isotope probing[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2013，110（12）：4720-4725.
[1 1 ] Li M，Bai YQ，Zhou JR，et al.Core Fucosylation of Maternal Milk N-Glycan Evokes B Cell Activation by Selectively Promoting the l-Fucose Metabolism of Gut Bifidobacterium spp. and Lactobacillus spp.[J]. mBio，2019，10（2）：128-129.
【关键词】人参；黄芪；抗衰老；肠道菌群
【中图分类号】R951 【文献标识码】A 【文章编号】2096-5249（2021）08-0006-02
衰老是一种自然的生命现象，以机体各部分组织和器官的功能活动逐渐衰退为特征。中医延年学说对人体衰老或早衰的认识源远流长，以气血津液学说最为经典，气为生命之源，“衰老”在中医中谓“气虚”，即元气不足，脏腑机能逐渐减退的虚弱症候，临床常用补益剂延年益寿[1]。现代研究认为，衰老是一个内外多种因素（基因、环境和精神心理等）共同作用的综合结果[2]，可由多种应激因素引起，如氧化应激、线粒体功能障碍等。近年来，研究发现，肠道微生物变化会导致机体免疫功能衰退，同时导致衰老相关的慢性疾病，提示肠道微生物可能对衰老产生重要作用[3]。课题组前提研究提示人参-黄芪具有调节肠道微生态功能，故本研究旨在探讨人参-黄芪对衰老大鼠模型肠道微生态的影响，探寻二者联合使用对肠道微生态的影响及抗衰老机理研究，为中医药抗衰老提供理论依据及实验数据。
1 材料与方法
1.1 实验动物
3月龄SPF级SD雄性大鼠30只由实验动物中心提供，体重分别为300～350 g/只。30只大鼠分为5组：对照组、模型组、人参组、黄芪组和人参黄芪组，大鼠在实验动物中心SPF环境下适应性喂养1周后用于试验研究，室温20～25℃，湿度40 %～60 %，定期紫外线灯消毒。
在模型组、人参组、黄芪组和人参黄芪组大鼠后肢外侧皮下部位连续注射D-半乳糖，注射剂量为0.125 g/kg·d，注射时间为每天上午9∶00～13∶00，连续注射40 d。
30只大鼠均在自由摄食、饮水，标准条件下饲养40 d。
1.2 干预方式
每日腹腔注射给予黄芪组大鼠200 mg/kg黄芪多糖，人参组大鼠40 mg/kg 人参总皂苷， 人参黄芪组大鼠200 mg/kg黄芪多糖及40 mg/kg 人参总皂苷， 同时给予对照组和衰老组大鼠等量生理盐水，连续注射8周。
1.3 观察指标
1.3.1 大鼠小肠形态：研究期间观察大鼠小肠形态变化。
1.3.2 大鼠肠道iNOS、zo-1、occludin、claudin-1蛋白表达检测：取体积100 mg冻存组织，以RIPA裂解液提取组织总蛋白，蛋白经纯化后进行定量，进行SDS-PAGE電泳，PAGE胶经硝酸纤维膜转膜后，分别孵育兔抗鼠iNOS、zo-1、occludin、claudin-1以及GAPDH一抗。再以HRP标记的二抗孵育过夜。硝酸纤维膜经定影、显影后，以Quantity One v4.4.0软件分析iNOS、zo-1、occludin、claudin-1以及GAPDH蛋白条带的光密度。
2 结果
2.1 人参-黄芪处理对衰老大鼠小肠形态的影响
如图1所示，与对照组大鼠相比较，大鼠经衰老诱导后，小肠绒毛表面细胞凋亡较为明显。而经过人参与黄芪处理后，显著抑制了大鼠小肠绒毛表面细胞的凋亡（人参组和黄芪组未观察小肠形态）。
2.2 人参和黄芪处理对衰老大鼠肠道iNOS、zo-1、occludin、claudin-1蛋白表达的影响
如图2所示，与对照组大鼠相比较，大鼠经衰老诱导后，小肠iNOS、occludin、claudin-1表达显著升高，但经过人参与黄芪分别处理后，iNOS、occludin、claudin-1的表达显著得到抑制。此外，与对照组大鼠相比较小肠zo-1表达显著降低，但经过人参与黄芪处理后，zo-1的表达显著得到提高。
3 讨论
随着人口老龄化进程的加剧，人们日益关注衰老问题及衰老所导致的疾病。研究显示，肠道微生物与机体发育和衰老密切相关，肠道菌群也叫“第二基因组”[4]。随着机体衰老，肠道微生物多样性减少，尤其是有益菌群锐减，导致许多衰老相关疾病，如免疫相关疾病、糖尿病等代谢疾病、神经退行性疾病等严重影响健康和生活质量。
《神农本草经》中记载：“人参主补五脏，安精神，定魂魄，止惊悸，除邪气，明目开心益智，久服轻身延年。”人参茎叶中提取的人参皂苷（Rb1、Rb2、Rc、Rg1、Rg2等）能不同程度的清除氧自由基，其中Rb1和Rg1被证实作用最强[5]。黄芪最早见于《五十二病方》，有“补气”之功，其活性成分黄芪甲苷[6]具有抗衰老、抗炎、免疫调节、抗氧化、抗纤维化等作用[7]。
本研究在衰老大鼠模型上证实了衰老诱导后，小肠绒毛表面细胞凋亡较为明显，小肠iNOS、occludin、claudin-1表达显著升高，zo-1表达显著降低；而经过人参与黄芪处理后，显著抑制了大鼠小肠绒毛表面细胞的凋亡，同时抑制iNOS、occludin、claudin-1的表达，升高zo-1表达；表明人参-黄芪联合应用可通过影响肠道菌群变化进而发挥抗衰老作用。衰老是人体必须经历的过程，从整体看，衰老代表健康的器官功能退化，但在细胞层面衰老也代表了细胞的功能减退和衰老凋亡的进程[8]。衰老发生的机制复杂多样，其中被广泛认可的假说是衰老受遗传因素、饮食习惯和运动等多种因素的影响，在炎症和氧化应激等多种机制的作用下引起细胞衰老等生理过程，进而导致机体各系统功能逐步退化[9]。而肠道微生物变化可以改变肠道屏障功能，破坏肠道屏障完整性，为后续的炎症和感染提供条件[10]。与此同时，肠道菌群失调，尤其是吲哚丙酸代谢相关菌群减少破坏肠道抗氧化功能；双歧杆菌和拟杆菌减少能够减少抗炎因子IL-10的含量，上调TNF-α和IL-17的含量[11]。以上均表明肠道微生物变化与衰老密切相关。而本研究通过实验已经证实，人参-黄芪联合作用能明显改善肠道微生物的紊乱，起到抗衰老的作用，为抗衰老机制的探索及临床上相关疾病的诊治提供有力证据和作用靶点，值得继续深入研究和应用推广。 参考文献
[1] 周玉，赵燕，马晖，等.中医药抗衰老作用机制研究进展[J].亚太传统医药，2016，12 （17）：50-52.
[2] Choi SH，Kim HJ，Cho HJ，et al.Gintonin-mediated release of astrocytic vascular endothelial growth factor protects cortical astrocytes from hypoxia-induced cell damages[J].J Ginseng Res，2019，43（2）：305-311.
[3] 李思慧，吳巧凤.肠道菌群对Th17/Treg免疫平衡和炎症性肠病影响的研究进展[J].免疫学杂志，2019，35（8）：722-726.
[4] 马明.人体肠道微生物组学与大健康产业[J].科学（上海），2018，70（6）：23-28，69.
[5] 周峰，李佳琪，周玉枝，等.肠道微生物与衰老[J].中国药学杂志，2019，54（10）：761-765.
[5] Kang S，Min H.Ginseng， the ’Immunity Boost’： The Effects of Panax ginseng on Immune System[J].J Ginseng Res.2012，36（4）：354-368.
[6] 朱嘉欢，黄小平，邓常清.黄芪和当归的主要活性成分配伍促进衰老造血干细胞增殖作用的研究[J].中草药，2019，50（1）：111-119.
[7] 苗雨丹，张浩，许妍妍.黄芪多糖对致衰老模型小鼠氧自由基水平的影响[J].中国老年学杂志，2017，37（17）：4193-4194.
[8] Ron，Sender，Shai，et al.Are We Really Vastly Outnumbered Revisiting the Ratio of Bacterial to Host Cells in Humans[J].Cell，2016，164（3）：337-340.
[9] Hwangbo DS，Lee HY，Abozaid LS，et al. Mechanisms of Lifespan Regulation by Calorie Restriction and Intermittent Fasting in Model Organisms[J].Nutrients，2020，12（4）：1194.
[10] Berry D，Stecher B，Schintlmeister A ，et al.Host-compound foraging by intestinal microbiota revealed by single-cell stable isotope probing[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2013，110（12）：4720-4725.
[1 1 ] Li M，Bai YQ，Zhou JR，et al.Core Fucosylation of Maternal Milk N-Glycan Evokes B Cell Activation by Selectively Promoting the l-Fucose Metabolism of Gut Bifidobacterium spp. and Lactobacillus spp.[J]. mBio，2019，10（2）：128-129.