【摘 要】
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目的 建立实时荧光环介导等温扩增(LAMP)法检测肺炎支原体.方法 在LAMP体系中添加适量荧光染料SYTO-9,通过实时定量PCR仪监测LAMP反应结果 .以肺炎支原体P1基因重组质粒制备
【机 构】
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江苏大学医学院,江苏镇江,212013;江苏大学附属医院检验科,江苏镇江,212000;镇江市第一人民医院儿科,江苏镇江,212000;镇江市高等专科学校医药与化材学院,江苏镇江,212028
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目的 建立实时荧光环介导等温扩增(LAMP)法检测肺炎支原体.方法 在LAMP体系中添加适量荧光染料SYTO-9,通过实时定量PCR仪监测LAMP反应结果 .以肺炎支原体P1基因重组质粒制备一系列浓度标准品,分别使用实时荧光LAMP法和SYBR GreenⅠ 染料LAMP法检测,比较2种方法 的检出限.肺炎支原体M129标准株菌液以10倍梯度稀释,分别以实时荧光LAMP法和肺炎支原体荧光PCR试剂盒检测,比较2种方法 灵敏度.以实时荧光LAMP法检测常见呼吸道感染病原体肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希菌基因组DNA,评估该方法 特异性.采集疑似肺炎支原体感染患儿咽拭子标本,分别以实时荧光LAMP法和荧光PCR法检测,比较2种方法 检出率差异.结果 实时荧光LAMP法可以检出P1基因最低限为103 copies/μL,当基因拷贝数大于104 copies/μL时,反应30 min样本组即可出现明显荧光信号.SYBR GreenⅠ染料LAMP法可以检出P1基因最低限为104 copies/μL,反应需1 h才可获得足够产物用于显色.实时荧光LAMP法灵敏度高于实时定量PCR法100倍,且对常见呼吸道病原体DNA无扩增.实时荧光LAMP法和荧光PCR法检测疑似肺炎支原体感染咽拭子标本的阳性率差异无统计学意义(P>0.05).结论 实时荧光LAMP法可以有效避免因开盖检测造成的气溶胶污染,反应时间短,灵敏度高,适于在基层医院中推广使用.
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