论文部分内容阅读
摘要 建立L（ ）-酒石酸生产过程中6种有机酸的快速HPLC同步检测方法。结果表明，最佳条件为以20 mmol磷酸二氢钾水溶液（用磷酸调pH值至2.5）∶甲醇=95∶5为流动相，检测波长采用206 nm，流速为1 mL/min，进样量为10 μL，柱温为30 ℃，可较好地分离和测定不同样品中的6种有机酸，且回收率高，重复性好。
关键词 HPLC；酒石酸；有机酸；检测
中图分类号 O657.7 2 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）17-0249-02
Abstract The analytical HPLC method that enables rapid quantification of six types of organic acids in the production of L（ ）-tartaric acid was established. The results showed that the HPLC optimized conditions were as follows：Aliquot samples were collected and subjected to HPLC at a flow rate of 1 mL/min using a solution of 5% methanol in phosphate buffer（20 mmol，pH=2.5）as the mobile phase，and injection volume was 10 μL. UV detection was performed at 206 nm，and all runs were carried out at 30 ℃.As a result，it′s able to accurately quantify the 6 kinds of organic acids，yielding minor variations in batch-to-batch reproducibility.
Key words HPLC；tartaric acid；organic acids；determination
酒石酸（Tartaric acid），即2，3-二羟基丁二酸，是一种羧酸﹐存在于多种植物中﹐如葡萄和罗望子﹐也是葡萄酒中主要的有机酸之一。酒石酸分子中有2个不对称碳原子，故有3种光学异构体，即右旋酒石酸或D-酒石酸、左旋酒石酸或L-酒石酸、内消旋酒石酸。
L（ ）-酒石酸最大的用途是作为饮料添加剂，其次是作为药物工业原料。在当代有机合成是非常重要的手性配体和手性子，可以用来制备许多著名的手性催化剂，以及作为手性源来合成复杂的天然产物分子。酒石酸也是一种抗氧化剂，在食品工业中有所应用。生化试验中可利用其作为除氧剂。
在生物转化法生产L（ ）-酒石酸的工业生产过程中，容易产生草酸、琥珀酸、乳酸、苹果酸、马来酸、富马酸等杂质有机酸，对生产过程和产品纯度造成困扰。目前关于有机酸的检测受到越来越多学者的关注[1-2]。1976年Hoefler和Coggon将高效液相色谱法（HPLC）首次用于有机酸类化合物的分析。HPLC分析有机酸不仅简便快捷，而且具有选择性好、准确度高的优点[3]。根据分离机理，有机酸的HPLC可以分成离子色谱（IC）、反相高效液相色潽法（RP-HPLC）和渗胶渗透色谱（GPC）三大类。然而，离子色谱对分析物的纯度要求较高，灵敏度不够高；GPC分离模式局限性较大；而RP-HPLC操作简单，对检测品要求不高，可以直接进行测定，是目前应用最广泛的有机酸检测方法[4-7]。在该分离模式中，有机酸分子直接在两相中分配，各种有机酸因分配系数不同而被分离。本研究利用高效液相色谱法，建立多种有机酸的快速检测方法，可用于生物转化法生产L（ ）-酒石酸过程的质量控制。
1 材料与方法
1.1 试验材料
主要仪器与器材：高效液相色谱仪（Agilent 1260）。试剂标准品：草酸、L-酒石酸、环氧琥珀酸、L-苹果酸、马来酸、富马酸均为分析纯。甲醇为色谱纯。磷酸二氢钾、磷酸均为分析纯。
1.2 试验方法
1.2.1 色谱条件选择。选用的色谱柱为Agilent SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相pH值选择：20 mmol磷酸二氢钾水溶液，用磷酸调pH值2.0、2.5、3.0、3.5，与甲醇以95∶5的体积比混合作为流动相；流动相流速选择：将流动相流速分别设置为0.5、0.8、1.0、1.2 mL/min；柱温的选择：柱温分别选择25、30、35、40 ℃[8-10]。
1.2.2 样品预处理。由于生物转化法生产L（ ）-酒石酸的过程中产生的底物合成液、转化液是澄清溶液，因此只需将这些样品稀释一定倍数，使其中有机酸浓度落在标准曲线线性范围内即可。
1.2.3 混合标准溶液配制。配制6种有机酸的标准储备液，浓度分别为草酸50 μg/mL、L-酒石酸1 mg/mL、环氧琥珀酸1 mg/mL、L-苹果酸4 mg/mL、马来酸30 μg/mL、富马酸100 μg/mL。准确移取6种有机酸的标准储备液适量，配制混合标准溶液，其中6种有机酸浓度分别为草酸0.1 μg/mL、L-酒石酸20 μg/mL、环氧琥珀酸25 μg/mL、L-苹果酸50 μg/mL、马来酸0.1 μg/mL、富马酸1 μg/mL。
1.2.4 有机酸标准曲线绘制。将配制好的混合标准溶液，在最佳色谱条件下测定，以有机酸浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线并得到回归方程。
1.2.5 精密度与重复性试验。日内精密度是将6种有机酸分别在1 d之内进样6次，求得相应的RSD值；日间精密度是将同一被测物连续测定6 d，求得相应的RSD值。重复性试验是将6种有机酸的混合标准溶液重复配制6次，测定后计算RSD值。 1.2.6 回收率试验。在底物合成液、转化液和成品溶液中定量添加有机酸标准品来检测该方法的加标回收率，并以百分比表示。
2 结果与分析
2.1 色谱条件选择
2.1.1 检测波长。对配制好的6种有机酸的混标溶液进行180～250 nm波长扫描，综合考虑样品测定的灵敏度后，选择206 nm为检测波长。
2.1.2 流动相pH值、流速及柱温。随着流动相流速的提高，出峰时间明显提前，综合考虑，选择1.0 mL/min作为检测流速；pH梯度试验中发现，随着pH值的提高，各峰分离度下降，综合考虑保留时间和分离度，调整流动相pH值2.5为最佳；柱温梯度试验中发现，柱温升高时，流动相黏度降低，传质阻力降低，有利于混合酸的分离，当柱温为30 ℃，各有机酸分离效果最佳。
2.1.3 6种有机酸混合标准样品色谱图。经试验，确定最佳色谱条件为20 mmol磷酸二氢钾水溶液（用磷酸调pH值至2.5）∶甲醇=95∶5，检测波长206 nm，流速1 mL/min，进样量10 μL，柱温30 ℃，所得混合标准样品色谱图如图1所示。
2.2 有机酸标准曲线绘制
根据最佳色谱条件，对6种有机酸进行HPLC分析，所得到的线性方程、相关性系数、相对标准偏差见表1。
2.3 精密度与重复性试验
按照1.2.5的方法进行精密度与重复性试验，结果如表2所示。由表2可以看出，本方法精密度和重复性试验结果较为理想。
2.4 回收率试验结果
按照1.2.6的试验方法进行试验，所得到结果如表3所示。
3 结论
通过试验建立了L（ ）-酒石酸生产过程中底物合成液、转化液和成品中6种有机酸的快速HPLC同步检测方法，经试验确定最佳色谱条件为以20 mmol磷酸二氢钾水溶液（用磷酸调pH值至2.5）∶甲醇=95∶5为流动相，检测波长采用206 nm，流速为1 mL/min，进样量为10 μL，柱温为30 ℃。在上述色谱条件下，成功实现了底物合成液、转化液和成品溶液中的6种有机酸成分的良好分离。该方法准确度、灵敏度高，回收率好，可作为L（ ）-酒石酸生产过程的质量控制的可靠方法。
4 参考文献
[1] FLORES P，HELLIN P，FENDOLL J.Determination of organic acids in fruits and vegetables by liquid chromatography with tandem-mass spectrometry[J].Food Chemistry，2012，132（2）：1049-1054.
[2] SHI JY，ZOU XB，HUANG XW，et al.Rapid detecting total acid content and classifying different types of vinegar based on near infrared spectroscopy and least-squares support vector machine[J].Food Chemistry，2013，138（1）：192-199.
[3] HOEFLER AC，COGGON P.Reversed-phase high-performance liquid chromatography of tea constituents[J].Journal of Chromatography A，1976，129：460-463.
[4] 丁明玉，陈培榕，罗国安.食品中有机酸的高效液相色谱分析法[J].色谱，1997，15（3）212-215.
[5] ZHENG YJ，DUAN YT，ZHANG YF，et al.Determination of organic acids in red wine and must on only one RP-LC-column directly after sample dilution and filtration[J].Chromatography，2009，69（11/12）：1391-1395.
[6] LIN JT，LIU SC，SHEN YC，et al.Comparison of various preparation methods for determination of organic acids in fruit vinegars with a simple ion-exclusion liquid chromatography[J].Food Analytical Methods，2011， 4（4）：531-539.
[7] SCHERER R，RYBKA ACP，BALLUS CA，et al.Validation of a HPLC method for simultaneous determination of main organic acids in fruits and juices[J].Food Chemistry，2012，135（1）：141-154.
[8] 翁民，胡敏杰，祝珍云.对硝基苯酰胺-L-酒石酸的HPLC测定[J].浙江化工，2004（3）：29.
[9] 林晓宏，唐玮，尹青，等.HPLC法测定酒石酸长春瑞滨脂质体注射液的含量[J].药物分析杂志，2012（10）：1882-1885.
[10] 裴琳，卢京光，陈涛，等.HPLC法同时测定酒石酸布托啡诺注射液中酒石酸布托啡诺和苄索氯铵的含量[J].药物分析杂志，2013（9）：1624-1627.
关键词 HPLC；酒石酸；有机酸；检测
中图分类号 O657.7 2 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）17-0249-02
Abstract The analytical HPLC method that enables rapid quantification of six types of organic acids in the production of L（ ）-tartaric acid was established. The results showed that the HPLC optimized conditions were as follows：Aliquot samples were collected and subjected to HPLC at a flow rate of 1 mL/min using a solution of 5% methanol in phosphate buffer（20 mmol，pH=2.5）as the mobile phase，and injection volume was 10 μL. UV detection was performed at 206 nm，and all runs were carried out at 30 ℃.As a result，it′s able to accurately quantify the 6 kinds of organic acids，yielding minor variations in batch-to-batch reproducibility.
Key words HPLC；tartaric acid；organic acids；determination
酒石酸（Tartaric acid），即2，3-二羟基丁二酸，是一种羧酸﹐存在于多种植物中﹐如葡萄和罗望子﹐也是葡萄酒中主要的有机酸之一。酒石酸分子中有2个不对称碳原子，故有3种光学异构体，即右旋酒石酸或D-酒石酸、左旋酒石酸或L-酒石酸、内消旋酒石酸。
L（ ）-酒石酸最大的用途是作为饮料添加剂，其次是作为药物工业原料。在当代有机合成是非常重要的手性配体和手性子，可以用来制备许多著名的手性催化剂，以及作为手性源来合成复杂的天然产物分子。酒石酸也是一种抗氧化剂，在食品工业中有所应用。生化试验中可利用其作为除氧剂。
在生物转化法生产L（ ）-酒石酸的工业生产过程中，容易产生草酸、琥珀酸、乳酸、苹果酸、马来酸、富马酸等杂质有机酸，对生产过程和产品纯度造成困扰。目前关于有机酸的检测受到越来越多学者的关注[1-2]。1976年Hoefler和Coggon将高效液相色谱法（HPLC）首次用于有机酸类化合物的分析。HPLC分析有机酸不仅简便快捷，而且具有选择性好、准确度高的优点[3]。根据分离机理，有机酸的HPLC可以分成离子色谱（IC）、反相高效液相色潽法（RP-HPLC）和渗胶渗透色谱（GPC）三大类。然而，离子色谱对分析物的纯度要求较高，灵敏度不够高；GPC分离模式局限性较大；而RP-HPLC操作简单，对检测品要求不高，可以直接进行测定，是目前应用最广泛的有机酸检测方法[4-7]。在该分离模式中，有机酸分子直接在两相中分配，各种有机酸因分配系数不同而被分离。本研究利用高效液相色谱法，建立多种有机酸的快速检测方法，可用于生物转化法生产L（ ）-酒石酸过程的质量控制。
1 材料与方法
1.1 试验材料
主要仪器与器材：高效液相色谱仪（Agilent 1260）。试剂标准品：草酸、L-酒石酸、环氧琥珀酸、L-苹果酸、马来酸、富马酸均为分析纯。甲醇为色谱纯。磷酸二氢钾、磷酸均为分析纯。
1.2 试验方法
1.2.1 色谱条件选择。选用的色谱柱为Agilent SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相pH值选择：20 mmol磷酸二氢钾水溶液，用磷酸调pH值2.0、2.5、3.0、3.5，与甲醇以95∶5的体积比混合作为流动相；流动相流速选择：将流动相流速分别设置为0.5、0.8、1.0、1.2 mL/min；柱温的选择：柱温分别选择25、30、35、40 ℃[8-10]。
1.2.2 样品预处理。由于生物转化法生产L（ ）-酒石酸的过程中产生的底物合成液、转化液是澄清溶液，因此只需将这些样品稀释一定倍数，使其中有机酸浓度落在标准曲线线性范围内即可。
1.2.3 混合标准溶液配制。配制6种有机酸的标准储备液，浓度分别为草酸50 μg/mL、L-酒石酸1 mg/mL、环氧琥珀酸1 mg/mL、L-苹果酸4 mg/mL、马来酸30 μg/mL、富马酸100 μg/mL。准确移取6种有机酸的标准储备液适量，配制混合标准溶液，其中6种有机酸浓度分别为草酸0.1 μg/mL、L-酒石酸20 μg/mL、环氧琥珀酸25 μg/mL、L-苹果酸50 μg/mL、马来酸0.1 μg/mL、富马酸1 μg/mL。
1.2.4 有机酸标准曲线绘制。将配制好的混合标准溶液，在最佳色谱条件下测定，以有机酸浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线并得到回归方程。
1.2.5 精密度与重复性试验。日内精密度是将6种有机酸分别在1 d之内进样6次，求得相应的RSD值；日间精密度是将同一被测物连续测定6 d，求得相应的RSD值。重复性试验是将6种有机酸的混合标准溶液重复配制6次，测定后计算RSD值。 1.2.6 回收率试验。在底物合成液、转化液和成品溶液中定量添加有机酸标准品来检测该方法的加标回收率，并以百分比表示。
2 结果与分析
2.1 色谱条件选择
2.1.1 检测波长。对配制好的6种有机酸的混标溶液进行180～250 nm波长扫描，综合考虑样品测定的灵敏度后，选择206 nm为检测波长。
2.1.2 流动相pH值、流速及柱温。随着流动相流速的提高，出峰时间明显提前，综合考虑，选择1.0 mL/min作为检测流速；pH梯度试验中发现，随着pH值的提高，各峰分离度下降，综合考虑保留时间和分离度，调整流动相pH值2.5为最佳；柱温梯度试验中发现，柱温升高时，流动相黏度降低，传质阻力降低，有利于混合酸的分离，当柱温为30 ℃，各有机酸分离效果最佳。
2.1.3 6种有机酸混合标准样品色谱图。经试验，确定最佳色谱条件为20 mmol磷酸二氢钾水溶液（用磷酸调pH值至2.5）∶甲醇=95∶5，检测波长206 nm，流速1 mL/min，进样量10 μL，柱温30 ℃，所得混合标准样品色谱图如图1所示。
2.2 有机酸标准曲线绘制
根据最佳色谱条件，对6种有机酸进行HPLC分析，所得到的线性方程、相关性系数、相对标准偏差见表1。
2.3 精密度与重复性试验
按照1.2.5的方法进行精密度与重复性试验，结果如表2所示。由表2可以看出，本方法精密度和重复性试验结果较为理想。
2.4 回收率试验结果
按照1.2.6的试验方法进行试验，所得到结果如表3所示。
3 结论
通过试验建立了L（ ）-酒石酸生产过程中底物合成液、转化液和成品中6种有机酸的快速HPLC同步检测方法，经试验确定最佳色谱条件为以20 mmol磷酸二氢钾水溶液（用磷酸调pH值至2.5）∶甲醇=95∶5为流动相，检测波长采用206 nm，流速为1 mL/min，进样量为10 μL，柱温为30 ℃。在上述色谱条件下，成功实现了底物合成液、转化液和成品溶液中的6种有机酸成分的良好分离。该方法准确度、灵敏度高，回收率好，可作为L（ ）-酒石酸生产过程的质量控制的可靠方法。
4 参考文献
[1] FLORES P，HELLIN P，FENDOLL J.Determination of organic acids in fruits and vegetables by liquid chromatography with tandem-mass spectrometry[J].Food Chemistry，2012，132（2）：1049-1054.
[2] SHI JY，ZOU XB，HUANG XW，et al.Rapid detecting total acid content and classifying different types of vinegar based on near infrared spectroscopy and least-squares support vector machine[J].Food Chemistry，2013，138（1）：192-199.
[3] HOEFLER AC，COGGON P.Reversed-phase high-performance liquid chromatography of tea constituents[J].Journal of Chromatography A，1976，129：460-463.
[4] 丁明玉，陈培榕，罗国安.食品中有机酸的高效液相色谱分析法[J].色谱，1997，15（3）212-215.
[5] ZHENG YJ，DUAN YT，ZHANG YF，et al.Determination of organic acids in red wine and must on only one RP-LC-column directly after sample dilution and filtration[J].Chromatography，2009，69（11/12）：1391-1395.
[6] LIN JT，LIU SC，SHEN YC，et al.Comparison of various preparation methods for determination of organic acids in fruit vinegars with a simple ion-exclusion liquid chromatography[J].Food Analytical Methods，2011， 4（4）：531-539.
[7] SCHERER R，RYBKA ACP，BALLUS CA，et al.Validation of a HPLC method for simultaneous determination of main organic acids in fruits and juices[J].Food Chemistry，2012，135（1）：141-154.
[8] 翁民，胡敏杰，祝珍云.对硝基苯酰胺-L-酒石酸的HPLC测定[J].浙江化工，2004（3）：29.
[9] 林晓宏，唐玮，尹青，等.HPLC法测定酒石酸长春瑞滨脂质体注射液的含量[J].药物分析杂志，2012（10）：1882-1885.
[10] 裴琳，卢京光，陈涛，等.HPLC法同时测定酒石酸布托啡诺注射液中酒石酸布托啡诺和苄索氯铵的含量[J].药物分析杂志，2013（9）：1624-1627.