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摘要：研究马尾藻多糖脂质体对南美白对虾免疫功能及抗病毒活性的影响。首先，选用72尾SPF南美白对虾，分为脂质体组和对照组，饲喂7 d后，测血淋巴上清中总蛋白含量，酚氧化酶、溶菌酶、碱性磷酸酶和酸性磷酸酶活性；然后，选用2批180尾SPF南美白对虾分别观察多糖脂质体对感染白斑综合征病毒或桃拉病毒对虾的保护作用，将180尾对虾随机分为6组，设空白对照组、阳性对照组，药物阳性对照组和高、中、低3个脂质体剂量组，饲喂7 d后攻毒，攻毒后观察7 d，记录发病数、死亡数。结果表明，在免疫试验中，脂质体组酚氧化酶、溶菌酶和碱性磷酸酶的活性极显著升高；在抗病毒保护试验中，多糖脂质体各剂量均能提高南美白对虾的存活率，高剂量组存活率最高。说明马尾藻多糖脂质体对南美白对虾具有免疫促进作用，并能提高其抗病力。
关键词：马尾藻多糖；脂质体；南美白对虾；免疫；病毒病
中图分类号：S945.4 9 文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0323-03
收稿日期：2014-11-20
基金项目：广西科学研究与技术开发计划（编号：桂科攻0992014-6）。
作者简介：崔月明（1980—），女，河南南阳人，博士研究生，讲师，研究方向多糖免疫药理学。E-mail：[email protected]。
通信作者：胡庭俊，博士，教授，研究方向为中药免疫药理学。E-mail：[email protected]。对虾白斑综合征（WSS）和桃拉综合征（TS）是危害我国对虾养殖业最多的两大病毒病，其大面积的暴发严重危害了对虾养殖业的发展。2001—2006年对南美白对虾养殖的主产地10个省份的流行病学调查研究显示，在所有检测到的病毒性疾病中白斑综合征病毒（WSSV）占63.84%，桃拉综合征病毒（TSV）占32.74%，成为危害最大的2种病毒病，并且其死亡率也呈现逐年递增的趋势[1]。2009—2010年在福建、海南和广东的流行病学调查中，对虾WSSV的阳性结果占27.1%，它和传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）同时呈现阳性的占16.95%[2]。针对这种病毒性疾病的大面积暴发，目前还没有有效的救治方法，因此对病毒病的有效防治已成为对虾养殖中的最主要问题[3]。对虾和其他无脊椎动物一样， 缺乏脊椎动物特异的抗原/抗体免疫反应机制， 虽然一些病毒的重组蛋白能够诱导特异的免疫反应，但这种保护作用只是暂时的[4]，因此完全寄希望于通过疫苗免疫来控制虾病是不切实际的。目前对病毒病的防治还是以防为主，报道称中草药类多糖、生物碱、有机酸、酮类等以及益生菌能激活对虾的免疫系统， 增强抗病力，从而达到防病治病的目的[5]。杨明用乌梅为主要材料的中药抗病毒复方饲喂南美白对虾，其中2%剂量的试验组促进对虾的生长最明显，酚氧化酶（PO）和过氧化物酶活性亦大大提高，表明中药复方能提高对虾的非特异性免疫力；在WSSV感染试验中，免疫保护率更是达到61.98%，效果极显著[6]。
马尾藻多糖（SP）作为海藻中一类具有较高抗病毒活性的硫酸多糖，添加在饲料中，不仅能促进南美白对虾的生长，而且对甲壳动物的酚氧化酶系统具有激活作用，能提高南美白对虾酸性磷酸酶（ACP）、 超氧化物歧化酶（SOD）及溶菌酶（LSZ）活性，并且在感染WSSV后，使免疫保护率从28%提高到74%[7]。脂质体是将药物包封于类脂质双分子层而制成的一种超微型球状药物载体制剂，结构类似生物膜，和靶细胞之间可通过内吞、融合、接触释放、吸附、脂质交换等方式起作用，具有减少药物治疗剂量、降低药物毒性、减轻变态反应和免疫反应、延缓释放、靶向给药等优点[8]。多糖脂质体作为免疫增强剂在提高对虾的非特异性免疫，增强对病毒性疾病的抵抗力方面，目前国内外都未见报道。马尾藻多糖脂质体纳米制剂（SPL）是将溶解的马尾藻多糖包封于磷脂双层膜中，形成稳定的球形纳米乳剂。本试验通过在南美白对虾饲料中添加SPL，测定对虾血淋巴液上清中总蛋白（TP）含量，酚氧化酶、溶菌酶、碱性磷酸酶（ALP）和酸性磷酸酶的活性，探讨SPL对南美白对虾非特异性免疫功能的调节作用；而后人工感染WSSV和TSV，观察SPL对南美白对虾抗病力的影响，评价SPL作为免疫增强剂在对虾养殖中的作用，为SPL的进一步推广应用提供依据。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1药物0.5%马尾藻多糖脂质体纳米制剂，由广西大学动物科学技术学院制备。对照药：盐酸左旋咪唑 黄芪多糖可溶性粉，湖南湘大兽药有限公司生产，商品名为瘟毒清，生产批号为20110680。
1.1.2试验动物SPF南美白对虾的幼虾500尾，取自广西水产研究所南美白对虾企沙养殖基地，暂养7 d后量体长、称质量，体长为（4.5±0.55） cm，体质量为（0.69±0.31） g，挑选规格基本一致的用于试验。
1.1.3饲料对虾饲料为豆粕、鱼粉、面粉、虾粉、鱼油、麦麸、多维多矿、大豆磷酯组成的对虾基础饲料，试验组按不同剂量将SPL喷涂于饲料上。
1.1.4病毒对虾白斑病综合征病毒、桃拉综合征病毒均由广西壮族自治区水产研究所保存，二者的TCID50均为10-6。
1.2试验方法
1.2.1试验分组及处理将72尾SPF南美白对虾分为2组——对照组和SPL组。对照组饲喂基础饲料，SPL组饲料添加SPL 50 mL/kg，连续饲喂7 d。2组分别饲养于150 cm×80 cm×60 cm的水族箱内，上午、下午各投料1次（按对虾体质量的5%投料），常温下喂养。
1.2.2血淋巴液制备用药后8 d，用带5号针头的1 mL注射器自虾的头胸甲后插入心脏取血淋巴液0.3 mL，置于 Eppendorf 管中，4 ℃冷藏，3 000 r/min 离心10 min，取上清用于免疫指标测定。 参考文献：
[1]朱泽闻，陈爱平，李文旭，等. 南美白对虾两大病毒病流行分析及趋势预测[J]. 科学养鱼，2007（4）：49-50.
[2]林开，侯崇林，谢荣辉，等. 三种对虾病毒在浙江省凡纳滨对虾中的流行性调查研究[J]. 水产科学，2013（3）：161-164.
[3]王蔚，章晓波. 对虾-病毒互作的分子机制研究[J]. 生命科学，2010，22（11）：1102-1106.
[4]Rout N， Kumar S， Jaganmohan S， et al. DNA vaccines encoding viral envelope proteins confer protective immunity against WSSV in black tiger shrimp[J]. Vaccine，2007，25（15）：2778-2786.
[5]谢芝勋. 对虾病毒病研究进展[J]. 动物医学进展，2003，24（2）：27-30.
[6]杨明. 中草药制剂在凡纳滨对虾抗病性能中的应用研究[D]. 厦门：集美大学，2012.
[7]何颖，陈忠伟，高建峰，等. 马尾藻多糖对南美白对虾免疫调节作用[J]. 安徽农业科学，2008，36（31）：13664-13665， 13680.
[8]姜华，高原，杨景明. 中药脂质体的研究进展[J]. 当代医学，2009（28）：12-13.
[9]Ashida M， Sderhll K. The prophenoloxidase activating system in crayfish[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B：Comparative Biochemistry，1984，77（1）：21-26.
[10]刘小玲，徐向群，黄燕华，等. 桦褐孔菌多糖对凡纳滨对虾生长和血清免疫相关酶活性的影响[J]. 水产科学，2014（4）：201-207.
[11]覃振林，韦海英，李学坚，等. 复方马齿苋影响南美白对虾非特异性免疫功能研究[J]. 水利渔业，2006（5）：100-101.
[12]文国樑，林黑着，李卓佳，等. 饲料中添加复方中草药对凡纳滨对虾生长、消化酶和免疫相关酶活性的影响[J]. 南方水产科学，2012（2）：58-63.
[13]李桂英，宋晓玲，孙艳，等. 几株肠道益生菌对凡纳滨对虾非特异免疫力和抗病力的影响[J]. 中国水产科学，2011，18（6）：1358-1367.
[14]王新霞. 对虾免疫增强剂的研究与应用[D]. 青岛：中国海洋大学，2004.
[15]杭小英，周志明，李倩，等. 不同养殖模式对南美白对虾生长、病害发生与水质的影响[J]. 江苏农业科学，2014，42（5）：191-193.
[16]胡振雄，刘利平. 凡纳滨对虾综合养殖的分类、存在问题及对策[J]. 江苏农业科学，2013，41（10）：202-204.
[17]宋晓玲，黄倢，王秀华，等. 白斑综合征病毒感染与对虾的免疫防御反应[J]. 中国水产科学，2006，13（6）：1033-1039.
[18]Sarathi M， Basha A N， Ravi M， et al. Clearance of white spot syndrome virus （WSSV） and immunological changes in experimentally WSSV-injected Macrobrachium rosenbergii[J]. Fish
关键词：马尾藻多糖；脂质体；南美白对虾；免疫；病毒病
中图分类号：S945.4 9 文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0323-03
收稿日期：2014-11-20
基金项目：广西科学研究与技术开发计划（编号：桂科攻0992014-6）。
作者简介：崔月明（1980—），女，河南南阳人，博士研究生，讲师，研究方向多糖免疫药理学。E-mail：[email protected]。
通信作者：胡庭俊，博士，教授，研究方向为中药免疫药理学。E-mail：[email protected]。对虾白斑综合征（WSS）和桃拉综合征（TS）是危害我国对虾养殖业最多的两大病毒病，其大面积的暴发严重危害了对虾养殖业的发展。2001—2006年对南美白对虾养殖的主产地10个省份的流行病学调查研究显示，在所有检测到的病毒性疾病中白斑综合征病毒（WSSV）占63.84%，桃拉综合征病毒（TSV）占32.74%，成为危害最大的2种病毒病，并且其死亡率也呈现逐年递增的趋势[1]。2009—2010年在福建、海南和广东的流行病学调查中，对虾WSSV的阳性结果占27.1%，它和传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）同时呈现阳性的占16.95%[2]。针对这种病毒性疾病的大面积暴发，目前还没有有效的救治方法，因此对病毒病的有效防治已成为对虾养殖中的最主要问题[3]。对虾和其他无脊椎动物一样， 缺乏脊椎动物特异的抗原/抗体免疫反应机制， 虽然一些病毒的重组蛋白能够诱导特异的免疫反应，但这种保护作用只是暂时的[4]，因此完全寄希望于通过疫苗免疫来控制虾病是不切实际的。目前对病毒病的防治还是以防为主，报道称中草药类多糖、生物碱、有机酸、酮类等以及益生菌能激活对虾的免疫系统， 增强抗病力，从而达到防病治病的目的[5]。杨明用乌梅为主要材料的中药抗病毒复方饲喂南美白对虾，其中2%剂量的试验组促进对虾的生长最明显，酚氧化酶（PO）和过氧化物酶活性亦大大提高，表明中药复方能提高对虾的非特异性免疫力；在WSSV感染试验中，免疫保护率更是达到61.98%，效果极显著[6]。
马尾藻多糖（SP）作为海藻中一类具有较高抗病毒活性的硫酸多糖，添加在饲料中，不仅能促进南美白对虾的生长，而且对甲壳动物的酚氧化酶系统具有激活作用，能提高南美白对虾酸性磷酸酶（ACP）、 超氧化物歧化酶（SOD）及溶菌酶（LSZ）活性，并且在感染WSSV后，使免疫保护率从28%提高到74%[7]。脂质体是将药物包封于类脂质双分子层而制成的一种超微型球状药物载体制剂，结构类似生物膜，和靶细胞之间可通过内吞、融合、接触释放、吸附、脂质交换等方式起作用，具有减少药物治疗剂量、降低药物毒性、减轻变态反应和免疫反应、延缓释放、靶向给药等优点[8]。多糖脂质体作为免疫增强剂在提高对虾的非特异性免疫，增强对病毒性疾病的抵抗力方面，目前国内外都未见报道。马尾藻多糖脂质体纳米制剂（SPL）是将溶解的马尾藻多糖包封于磷脂双层膜中，形成稳定的球形纳米乳剂。本试验通过在南美白对虾饲料中添加SPL，测定对虾血淋巴液上清中总蛋白（TP）含量，酚氧化酶、溶菌酶、碱性磷酸酶（ALP）和酸性磷酸酶的活性，探讨SPL对南美白对虾非特异性免疫功能的调节作用；而后人工感染WSSV和TSV，观察SPL对南美白对虾抗病力的影响，评价SPL作为免疫增强剂在对虾养殖中的作用，为SPL的进一步推广应用提供依据。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1药物0.5%马尾藻多糖脂质体纳米制剂，由广西大学动物科学技术学院制备。对照药：盐酸左旋咪唑 黄芪多糖可溶性粉，湖南湘大兽药有限公司生产，商品名为瘟毒清，生产批号为20110680。
1.1.2试验动物SPF南美白对虾的幼虾500尾，取自广西水产研究所南美白对虾企沙养殖基地，暂养7 d后量体长、称质量，体长为（4.5±0.55） cm，体质量为（0.69±0.31） g，挑选规格基本一致的用于试验。
1.1.3饲料对虾饲料为豆粕、鱼粉、面粉、虾粉、鱼油、麦麸、多维多矿、大豆磷酯组成的对虾基础饲料，试验组按不同剂量将SPL喷涂于饲料上。
1.1.4病毒对虾白斑病综合征病毒、桃拉综合征病毒均由广西壮族自治区水产研究所保存，二者的TCID50均为10-6。
1.2试验方法
1.2.1试验分组及处理将72尾SPF南美白对虾分为2组——对照组和SPL组。对照组饲喂基础饲料，SPL组饲料添加SPL 50 mL/kg，连续饲喂7 d。2组分别饲养于150 cm×80 cm×60 cm的水族箱内，上午、下午各投料1次（按对虾体质量的5%投料），常温下喂养。
1.2.2血淋巴液制备用药后8 d，用带5号针头的1 mL注射器自虾的头胸甲后插入心脏取血淋巴液0.3 mL，置于 Eppendorf 管中，4 ℃冷藏，3 000 r/min 离心10 min，取上清用于免疫指标测定。 参考文献：
[1]朱泽闻，陈爱平，李文旭，等. 南美白对虾两大病毒病流行分析及趋势预测[J]. 科学养鱼，2007（4）：49-50.
[2]林开，侯崇林，谢荣辉，等. 三种对虾病毒在浙江省凡纳滨对虾中的流行性调查研究[J]. 水产科学，2013（3）：161-164.
[3]王蔚，章晓波. 对虾-病毒互作的分子机制研究[J]. 生命科学，2010，22（11）：1102-1106.
[4]Rout N， Kumar S， Jaganmohan S， et al. DNA vaccines encoding viral envelope proteins confer protective immunity against WSSV in black tiger shrimp[J]. Vaccine，2007，25（15）：2778-2786.
[5]谢芝勋. 对虾病毒病研究进展[J]. 动物医学进展，2003，24（2）：27-30.
[6]杨明. 中草药制剂在凡纳滨对虾抗病性能中的应用研究[D]. 厦门：集美大学，2012.
[7]何颖，陈忠伟，高建峰，等. 马尾藻多糖对南美白对虾免疫调节作用[J]. 安徽农业科学，2008，36（31）：13664-13665， 13680.
[8]姜华，高原，杨景明. 中药脂质体的研究进展[J]. 当代医学，2009（28）：12-13.
[9]Ashida M， Sderhll K. The prophenoloxidase activating system in crayfish[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B：Comparative Biochemistry，1984，77（1）：21-26.
[10]刘小玲，徐向群，黄燕华，等. 桦褐孔菌多糖对凡纳滨对虾生长和血清免疫相关酶活性的影响[J]. 水产科学，2014（4）：201-207.
[11]覃振林，韦海英，李学坚，等. 复方马齿苋影响南美白对虾非特异性免疫功能研究[J]. 水利渔业，2006（5）：100-101.
[12]文国樑，林黑着，李卓佳，等. 饲料中添加复方中草药对凡纳滨对虾生长、消化酶和免疫相关酶活性的影响[J]. 南方水产科学，2012（2）：58-63.
[13]李桂英，宋晓玲，孙艳，等. 几株肠道益生菌对凡纳滨对虾非特异免疫力和抗病力的影响[J]. 中国水产科学，2011，18（6）：1358-1367.
[14]王新霞. 对虾免疫增强剂的研究与应用[D]. 青岛：中国海洋大学，2004.
[15]杭小英，周志明，李倩，等. 不同养殖模式对南美白对虾生长、病害发生与水质的影响[J]. 江苏农业科学，2014，42（5）：191-193.
[16]胡振雄，刘利平. 凡纳滨对虾综合养殖的分类、存在问题及对策[J]. 江苏农业科学，2013，41（10）：202-204.
[17]宋晓玲，黄倢，王秀华，等. 白斑综合征病毒感染与对虾的免疫防御反应[J]. 中国水产科学，2006，13（6）：1033-1039.
[18]Sarathi M， Basha A N， Ravi M， et al. Clearance of white spot syndrome virus （WSSV） and immunological changes in experimentally WSSV-injected Macrobrachium rosenbergii[J]. Fish