【摘 要】
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目的 改进DNA亚硫酸氢盐测序法(bisulfite genomic sequencing,BGS),建立一种简便快速的甲基化标记筛查技术.方法 基因组DNA在亚硫酸氢盐处理、脱盐纯化后直接进入碱性的PCR
【机 构】
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河南科技大学法医学院,河南科技大学法医学院医学院,华中科技大学同济医学院
【基金项目】
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国家自然科学基金;河南科技大学校科研和教改项目
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目的 改进DNA亚硫酸氢盐测序法(bisulfite genomic sequencing,BGS),建立一种简便快速的甲基化标记筛查技术.方法 基因组DNA在亚硫酸氢盐处理、脱盐纯化后直接进入碱性的PCR体系,通过延长预变性时间完成修饰过程,然后进行常规亚硫酸氢盐PCR(bisulfite-PCR,BSP)扩增;首轮扩增产物再用5端加有高GC标签序列的引物进行2次扩增,达到调整GC含量和直接测序的目的 .同时用传统和改进BGS法检测3T3-L1细胞肿瘤坏死因子α(TNF-α)基因和Hela细胞雄激素受体基因启动子的甲基化情况,以评估改进方案的可行性.并用Alu序列实时定量BSP技术比较传统和改进BGS法的灵敏度.结果 无论是高甲基化还是低甲基化片段,改进的BGS法均可实现BSP产物的直接测序,结果与传统法一致.改进法修饰的DNA转化率达到100%,特异度＞93.75%,灵敏度显著高于传统方法(t=2.978 2,P＜0.05),并有良好的重复性.结论 改进后的BGS方法简单灵敏,可用于甲基化标记的快速筛查.
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