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摘要
自2009年起，甘肃定西地区出现了甘蓝植株矮化、叶片黄化、枯萎甚至死亡的现象。2015年8月，我们采集了田间病株样本，使用常规组织分离法对病原菌进行了分离和纯化，依据柯赫氏法则进行了病原菌确认，并通过形态学和分子生物学方法对病原菌进行了鉴定。结果表明病原菌的形态学特征与尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum一致，其rDNAITS、rDNAIGS以及EF1α序列与尖孢镰刀菌F.oxysporum相似性达99%，基于病原菌及尖孢镰刀菌各代表专化型EF1α序列构建的系统发育树将该菌与尖孢镰刀菌黏团专化型F.oxysporum f.sp. conglutinans聚为一类，故引致甘肃定西地区甘蓝枯萎病的病原菌为尖孢镰刀菌黏团专化型F.oxysporum f.sp. conglutinans。
关键词
EF1α；Fusarium oxysporum f.sp. conglutinans；镰刀菌
中图分类号：
S 436.35
文献标识码：A
DOI：10.3969/j.issn.05291542.2017.04.032
Abstract
Symptoms of stunting， leaf yellowing， withered and dead of cabbage were observed in Dingxi District， Gansu Province since 2009. Samples were collected from diseased field in August， 2015. The pathogen was isolated and purified by the method of general tissue isolation， confirmed according to Koch’s postulates， and identified by morphologic characteristics and molecular identification. The results showed that morphologic characteristics of the pathogen were consistent with those of Fusarium oxysporum. The similarity of rDNAITS， rDNAIGS and EF1α between F.oxysporum and the pathogen is 99%. The phylogenetic analysis of EF1α gene sequences of F.oxysporum formae speciales and the pathogen showed that the pathogen was classified as F.oxysporum f.sp. conglutinans. Thus， the pathogen of cabbage wilt in Dingxi， Gansu was F.oxysporum f.sp. conglutinans.
Key words
EF1α；Fusarium oxysporum f.sp. conglutinans；Fusarium
甘藍枯萎病是一种危害性极强的土传性病害，最早于1899年发现于美国纽约州，目前在全世界多数夏秋甘蓝栽培地区都有发生，如美国、加拿大、希腊、日本等[14]。在我国，该病害仅在北京延庆和山西寿阳地区有病原菌分离鉴定的记载[58]。
甘肃省定西市位于甘肃省中部，地处秦岭以西黄土高原沟壑丘陵区，属于南温带半湿润、中温带半干旱区，夏季气候凉爽，雨量相对充沛，昼夜温差大，有利于各类蔬菜干物质的积累，因此成为西北最大的高原夏菜产地。甘蓝作为当地的重要经济作物之一，有着悠久的种植历史和近0.67万hm2的种植面积。但自2009年起，在田间出现了甘蓝叶片黄化，植株枯萎、死亡等症状。2016年，该病害的累计危害面积近0.2万hm2，占当地甘蓝种植总面积的30%，严重影响了甘蓝的质量和产量，造成了严重的经济损失。本文从甘肃定西地区采集了发病甘蓝样品，并进行了病原菌的分离与鉴定。现将结果报道如下。
1材料与方法
1.1病原菌分离纯化
2015年8月于甘肃省定西市安定区采集具有典型症状的病害样品，用常规组织分离方法进行病原菌分离与纯化[9]。
1.2致病性测定
采用蘸根法对分离物进行致病性测定。将分离物于马铃薯葡萄糖液体培养基（potato dextrose broth， PDB）中摇培3 d后，滤除菌丝，收集孢子悬浮液，将其孢子浓度调至1×107 个/mL。将两叶一心期‘秋悦’甘蓝（邢蔬种业有限公司）幼苗的根部浸于孢子悬浮液中15 min，移植在装有无菌土的10 cm×10 cm（口径×高度）营养钵中，以无菌水蘸根处理的甘蓝幼苗作为空白对照。14 d后观察记载甘蓝发病情况。同时，采用常规组织分离方法对病原菌进行再分离，将分离物与初始接种体进行形态学比较。
1.3病原菌形态特征观察
将病原菌接种于马铃薯葡萄糖培养基（potato dextrose agar， PDA）上，25℃黑暗培养，3 d后观察菌落形态特征，并在光学显微镜下观察菌丝、分生孢子及产孢结构等形态特征。
1.4病原菌分子鉴定
1.4.1DNA提取
将病原菌接种于铺有玻璃纸的PDA平板上，25℃黑暗培养5 d后收集菌丝，干燥后取0.2 g菌丝于研钵中，加入液氮研磨至粉状后置于无菌的2.0 mL离心管中，加入800 μL 2% CTAB溶液混匀，65℃水浴15 min；然后加入800 μL酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1），混匀后离心15 min （12 000 r/min），取上清液，在上清液中加入800 μL酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1），混匀后离心15 min （12 000 r/min），取上清液，在上清液中加入350 μL冰异丙醇，混匀后于4℃下静置30 min，在4℃条件下离心15 min （12 000 r/min），弃上清液，用75%乙醇洗涤沉淀2次，再用无水乙醇洗涤1次，晾干后加入50 μL超纯水充分溶解。利用Nanodrop2000检测合格后，于-20℃下保存备用。 1.4.2病原菌ITS、IGS及EF1α序列扩增及测序
PCR扩增病原菌核糖体DNA内转录间隔区（ribosome DNA internal transcribed spacer， rDNAITS）、核糖体DNA基因间隔区（intergenic spacer， IGS）及延长因子-1α（elongation factors-1α， EF1α）序列。反应体系25 μL：上下游引物（10 μmol/L） 各0.5 μL，10×TransTaqT Buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，TransTaqT DNA polymerase 0.25 μL，模板DNA （50 ng/μL） l μL， ddH2O 18.25 μL。所用引物及PCR程序见表1。PCR产物送英潍捷基（上海）贸易有限公司进行测序。
1.4.3数据分析
将测序结果进行BLAST比对分析。从GenBank下载镰刀菌属代表种及尖孢镰刀菌不同专化型菌株的EF1α序列，用ClustalX（1.8）进行多重序列比对后，将序列信息导入MEGA（4.0）通过邻接法（neighborjoining）构建系统发育树，同时利用Bootstrap（10 000次重复）检验各分支的置信度。
2结果与分析
2.1病害症状
甘蓝枯萎病在田间会形成典型的发病中心，中心的面积表现出连年扩展的趋势，所辐射的区域也逐年扩大。处于发病中心边缘的病株一般发病较轻，仅植株下部部分叶片表现出沿叶脉黄化并伴有轻微萎蔫的现象，病株茎部横截面维管束处明显变褐，越靠近发病中心，病情越加严重，病株叶片几乎完全黄化，植株矮化枯死，以致田间出现明显的缺苗断垄现象（图1）。
2.2致病性测定
经过病原菌的分离与纯化后共得到17个分离物，根据形态学特征归为DXF001、DXF002、DXF003和DXF004四类。其中，DXF001包含11个分离物，占总分离物的64.7%；DXF002包含3个分离物，占总分离物的17.6%；DXF003包含2个分离物，占总分离物的11.8%；DXF004包含1个分离物，占总分离物的5.9%。从每类分离物中选取一个代表性菌株，分别为DXF00101、DXF00201、DXF00301和DXF00401，用于致病性测定。结果显示，接种14 d后只有接种DXF00101的植株表现出典型的甘蓝枯萎病症状（图2 b）。再分离物与DXF00101表现出一致的形态学特征，说明DXF00101为甘蓝枯萎病的病原菌。
2.3病原菌形态特征
在PDA培养基平板上培养4 d后，病原菌菌落圆形白色，气生菌丝致密（图3a）；显微观察可见其菌丝呈丝状、无色并伴有隔膜。病原菌产生大量的小型分生孢子和少量的大型分生孢子，其中小型分生孢子为卵圆形至长椭球形或肾型，无隔膜或具1个隔膜，大小为（3.8～15.0）μm×（1.5～5.0）μm，假头状着生于细长、瓶状的分生孢子梗上；大型分生孢子镰刀状，两端尖，一般具3～5个隔膜，大小为（18.6～33.8）μm×（3.2～6.2）μm（图3b）。根据病原菌的形态学特征，依据Booth的镰刀菌属分类系统[13]，该病原菌被鉴定为尖孢镰刀菌F.oxysporum。
2.4病原菌的分子鉴定
病原菌ITS、IGS及EF1α序列的测序结果在GenBank的注册号分别为LC165017、LC165016和LC165018，BLAST分析结果显示这3个序列分别与尖孢镰刀菌F.oxysporum的相似性达到了99%、99%和100%。利用病原菌与尖孢镰刀菌各专化型菌株的EF1α序列信息，构建系统发育树，结果显示EF1α可以对Fusarium oxysporum f.sp. conglutinans、Fusarium oxysporum f.sp. lilii、Fusarium oxysporum f.sp. melonis等10个尖孢镰刀菌专化型进行聚类（图4）。最终DXF00101被鉴定为尖孢镰刀菌黏团专化型（F.oxysporum f.sp. conglutinans）。
3讨论
甘蓝枯萎病首次发现于北京延庆地区，其病原菌被确定为尖孢镰刀菌黏团专化型F.oxysporum f.sp. conglutinans[5，7]。张扬等報道，在北京延庆地区除尖孢镰刀菌黏团专化型F.oxysporum f.sp. conglutinans外，轮枝样镰刀菌F.verticillioides也可导致甘蓝枯萎病的发生[6]。田仁鹏从山西寿阳地区甘蓝枯萎病株上分离到的GLHW1，经鉴定为尖孢镰刀菌F.oxysporum[8]。本文则通过形态学观察结合分子生物学方法将甘肃定西地区甘蓝枯萎病鉴定为尖孢镰刀菌黏团专化型F.oxysporum f.sp. conglutinans。
随着现代分子生物学技术的发展，病原菌的鉴定不再局限于形态学的观察。本文对病原菌的ITS序列进行了测序，通过序列比对将病原菌鉴定为尖孢镰刀菌F.oxysporum。虽然ITS在进化的过程中具有高度的保守性，但是由于镰刀菌ITS2存在非同源的拷贝，可能会导致不准确的鉴定结果[14]。而EF1α序列对镰刀菌系统发育学种的鉴定具有很大的可用性，它在镰刀菌种的水平上具有丰富的信息量，在镰刀菌属中也并未发现 EF1α 序列的非直系同源拷贝[12]。目前已有很多学者利用EF1α构建系统发育树成功地对镰刀菌进行了鉴定[1517]。为了保证鉴定结果的准确性，本文对病原菌的EF1α序列进行了扩增、测序，并将测序结果与其他尖孢镰刀菌专化型的EF1α序列进行建树分析，结果显示，EF1α基因可以对Fusarium oxysporum f.sp. conglutinans、Fusarium oxysporum f.sp. lilii、Fusarium oxysporum f.sp. melonis等10个尖孢镰刀菌专化型进行聚类，本文所分离的病原菌划归于尖孢镰刀菌黏团专化型F.oxysporum f.sp. conglutinans，与前人的研究结果相一致[57]。 有文献曾报道尖孢镰刀菌黏团专化型F.oxysporum f.sp. conglutinans的寄主范围十分广泛，不仅可以侵染大多数十字花科作物，还能侵染茄科、葫芦科、豆科、菊科、旋花科、伞形科及百合科等主要蔬菜作物，并使其成为无症带菌的隐性寄主[3，5，1819]。而甘肃定西是西北最大的高原夏菜产地之一，蔬菜品种多，种植面积广，因此尖孢镰刀菌黏团专化型F.oxysporum f.sp. conglutinans不仅会对当地甘蓝的生产造成严重的影响，也会成为其他蔬菜生产的潜在隐患。本研究结果为当地甘蓝枯萎病的防治奠定了可靠的理论基础。
参考文献
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（责任编辑：杨明丽）
自2009年起，甘肃定西地区出现了甘蓝植株矮化、叶片黄化、枯萎甚至死亡的现象。2015年8月，我们采集了田间病株样本，使用常规组织分离法对病原菌进行了分离和纯化，依据柯赫氏法则进行了病原菌确认，并通过形态学和分子生物学方法对病原菌进行了鉴定。结果表明病原菌的形态学特征与尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum一致，其rDNAITS、rDNAIGS以及EF1α序列与尖孢镰刀菌F.oxysporum相似性达99%，基于病原菌及尖孢镰刀菌各代表专化型EF1α序列构建的系统发育树将该菌与尖孢镰刀菌黏团专化型F.oxysporum f.sp. conglutinans聚为一类，故引致甘肃定西地区甘蓝枯萎病的病原菌为尖孢镰刀菌黏团专化型F.oxysporum f.sp. conglutinans。
关键词
EF1α；Fusarium oxysporum f.sp. conglutinans；镰刀菌
中图分类号：
S 436.35
文献标识码：A
DOI：10.3969/j.issn.05291542.2017.04.032
Abstract
Symptoms of stunting， leaf yellowing， withered and dead of cabbage were observed in Dingxi District， Gansu Province since 2009. Samples were collected from diseased field in August， 2015. The pathogen was isolated and purified by the method of general tissue isolation， confirmed according to Koch’s postulates， and identified by morphologic characteristics and molecular identification. The results showed that morphologic characteristics of the pathogen were consistent with those of Fusarium oxysporum. The similarity of rDNAITS， rDNAIGS and EF1α between F.oxysporum and the pathogen is 99%. The phylogenetic analysis of EF1α gene sequences of F.oxysporum formae speciales and the pathogen showed that the pathogen was classified as F.oxysporum f.sp. conglutinans. Thus， the pathogen of cabbage wilt in Dingxi， Gansu was F.oxysporum f.sp. conglutinans.
Key words
EF1α；Fusarium oxysporum f.sp. conglutinans；Fusarium
甘藍枯萎病是一种危害性极强的土传性病害，最早于1899年发现于美国纽约州，目前在全世界多数夏秋甘蓝栽培地区都有发生，如美国、加拿大、希腊、日本等[14]。在我国，该病害仅在北京延庆和山西寿阳地区有病原菌分离鉴定的记载[58]。
甘肃省定西市位于甘肃省中部，地处秦岭以西黄土高原沟壑丘陵区，属于南温带半湿润、中温带半干旱区，夏季气候凉爽，雨量相对充沛，昼夜温差大，有利于各类蔬菜干物质的积累，因此成为西北最大的高原夏菜产地。甘蓝作为当地的重要经济作物之一，有着悠久的种植历史和近0.67万hm2的种植面积。但自2009年起，在田间出现了甘蓝叶片黄化，植株枯萎、死亡等症状。2016年，该病害的累计危害面积近0.2万hm2，占当地甘蓝种植总面积的30%，严重影响了甘蓝的质量和产量，造成了严重的经济损失。本文从甘肃定西地区采集了发病甘蓝样品，并进行了病原菌的分离与鉴定。现将结果报道如下。
1材料与方法
1.1病原菌分离纯化
2015年8月于甘肃省定西市安定区采集具有典型症状的病害样品，用常规组织分离方法进行病原菌分离与纯化[9]。
1.2致病性测定
采用蘸根法对分离物进行致病性测定。将分离物于马铃薯葡萄糖液体培养基（potato dextrose broth， PDB）中摇培3 d后，滤除菌丝，收集孢子悬浮液，将其孢子浓度调至1×107 个/mL。将两叶一心期‘秋悦’甘蓝（邢蔬种业有限公司）幼苗的根部浸于孢子悬浮液中15 min，移植在装有无菌土的10 cm×10 cm（口径×高度）营养钵中，以无菌水蘸根处理的甘蓝幼苗作为空白对照。14 d后观察记载甘蓝发病情况。同时，采用常规组织分离方法对病原菌进行再分离，将分离物与初始接种体进行形态学比较。
1.3病原菌形态特征观察
将病原菌接种于马铃薯葡萄糖培养基（potato dextrose agar， PDA）上，25℃黑暗培养，3 d后观察菌落形态特征，并在光学显微镜下观察菌丝、分生孢子及产孢结构等形态特征。
1.4病原菌分子鉴定
1.4.1DNA提取
将病原菌接种于铺有玻璃纸的PDA平板上，25℃黑暗培养5 d后收集菌丝，干燥后取0.2 g菌丝于研钵中，加入液氮研磨至粉状后置于无菌的2.0 mL离心管中，加入800 μL 2% CTAB溶液混匀，65℃水浴15 min；然后加入800 μL酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1），混匀后离心15 min （12 000 r/min），取上清液，在上清液中加入800 μL酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1），混匀后离心15 min （12 000 r/min），取上清液，在上清液中加入350 μL冰异丙醇，混匀后于4℃下静置30 min，在4℃条件下离心15 min （12 000 r/min），弃上清液，用75%乙醇洗涤沉淀2次，再用无水乙醇洗涤1次，晾干后加入50 μL超纯水充分溶解。利用Nanodrop2000检测合格后，于-20℃下保存备用。 1.4.2病原菌ITS、IGS及EF1α序列扩增及测序
PCR扩增病原菌核糖体DNA内转录间隔区（ribosome DNA internal transcribed spacer， rDNAITS）、核糖体DNA基因间隔区（intergenic spacer， IGS）及延长因子-1α（elongation factors-1α， EF1α）序列。反应体系25 μL：上下游引物（10 μmol/L） 各0.5 μL，10×TransTaqT Buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，TransTaqT DNA polymerase 0.25 μL，模板DNA （50 ng/μL） l μL， ddH2O 18.25 μL。所用引物及PCR程序见表1。PCR产物送英潍捷基（上海）贸易有限公司进行测序。
1.4.3数据分析
将测序结果进行BLAST比对分析。从GenBank下载镰刀菌属代表种及尖孢镰刀菌不同专化型菌株的EF1α序列，用ClustalX（1.8）进行多重序列比对后，将序列信息导入MEGA（4.0）通过邻接法（neighborjoining）构建系统发育树，同时利用Bootstrap（10 000次重复）检验各分支的置信度。
2结果与分析
2.1病害症状
甘蓝枯萎病在田间会形成典型的发病中心，中心的面积表现出连年扩展的趋势，所辐射的区域也逐年扩大。处于发病中心边缘的病株一般发病较轻，仅植株下部部分叶片表现出沿叶脉黄化并伴有轻微萎蔫的现象，病株茎部横截面维管束处明显变褐，越靠近发病中心，病情越加严重，病株叶片几乎完全黄化，植株矮化枯死，以致田间出现明显的缺苗断垄现象（图1）。
2.2致病性测定
经过病原菌的分离与纯化后共得到17个分离物，根据形态学特征归为DXF001、DXF002、DXF003和DXF004四类。其中，DXF001包含11个分离物，占总分离物的64.7%；DXF002包含3个分离物，占总分离物的17.6%；DXF003包含2个分离物，占总分离物的11.8%；DXF004包含1个分离物，占总分离物的5.9%。从每类分离物中选取一个代表性菌株，分别为DXF00101、DXF00201、DXF00301和DXF00401，用于致病性测定。结果显示，接种14 d后只有接种DXF00101的植株表现出典型的甘蓝枯萎病症状（图2 b）。再分离物与DXF00101表现出一致的形态学特征，说明DXF00101为甘蓝枯萎病的病原菌。
2.3病原菌形态特征
在PDA培养基平板上培养4 d后，病原菌菌落圆形白色，气生菌丝致密（图3a）；显微观察可见其菌丝呈丝状、无色并伴有隔膜。病原菌产生大量的小型分生孢子和少量的大型分生孢子，其中小型分生孢子为卵圆形至长椭球形或肾型，无隔膜或具1个隔膜，大小为（3.8～15.0）μm×（1.5～5.0）μm，假头状着生于细长、瓶状的分生孢子梗上；大型分生孢子镰刀状，两端尖，一般具3～5个隔膜，大小为（18.6～33.8）μm×（3.2～6.2）μm（图3b）。根据病原菌的形态学特征，依据Booth的镰刀菌属分类系统[13]，该病原菌被鉴定为尖孢镰刀菌F.oxysporum。
2.4病原菌的分子鉴定
病原菌ITS、IGS及EF1α序列的测序结果在GenBank的注册号分别为LC165017、LC165016和LC165018，BLAST分析结果显示这3个序列分别与尖孢镰刀菌F.oxysporum的相似性达到了99%、99%和100%。利用病原菌与尖孢镰刀菌各专化型菌株的EF1α序列信息，构建系统发育树，结果显示EF1α可以对Fusarium oxysporum f.sp. conglutinans、Fusarium oxysporum f.sp. lilii、Fusarium oxysporum f.sp. melonis等10个尖孢镰刀菌专化型进行聚类（图4）。最终DXF00101被鉴定为尖孢镰刀菌黏团专化型（F.oxysporum f.sp. conglutinans）。
3讨论
甘蓝枯萎病首次发现于北京延庆地区，其病原菌被确定为尖孢镰刀菌黏团专化型F.oxysporum f.sp. conglutinans[5，7]。张扬等報道，在北京延庆地区除尖孢镰刀菌黏团专化型F.oxysporum f.sp. conglutinans外，轮枝样镰刀菌F.verticillioides也可导致甘蓝枯萎病的发生[6]。田仁鹏从山西寿阳地区甘蓝枯萎病株上分离到的GLHW1，经鉴定为尖孢镰刀菌F.oxysporum[8]。本文则通过形态学观察结合分子生物学方法将甘肃定西地区甘蓝枯萎病鉴定为尖孢镰刀菌黏团专化型F.oxysporum f.sp. conglutinans。
随着现代分子生物学技术的发展，病原菌的鉴定不再局限于形态学的观察。本文对病原菌的ITS序列进行了测序，通过序列比对将病原菌鉴定为尖孢镰刀菌F.oxysporum。虽然ITS在进化的过程中具有高度的保守性，但是由于镰刀菌ITS2存在非同源的拷贝，可能会导致不准确的鉴定结果[14]。而EF1α序列对镰刀菌系统发育学种的鉴定具有很大的可用性，它在镰刀菌种的水平上具有丰富的信息量，在镰刀菌属中也并未发现 EF1α 序列的非直系同源拷贝[12]。目前已有很多学者利用EF1α构建系统发育树成功地对镰刀菌进行了鉴定[1517]。为了保证鉴定结果的准确性，本文对病原菌的EF1α序列进行了扩增、测序，并将测序结果与其他尖孢镰刀菌专化型的EF1α序列进行建树分析，结果显示，EF1α基因可以对Fusarium oxysporum f.sp. conglutinans、Fusarium oxysporum f.sp. lilii、Fusarium oxysporum f.sp. melonis等10个尖孢镰刀菌专化型进行聚类，本文所分离的病原菌划归于尖孢镰刀菌黏团专化型F.oxysporum f.sp. conglutinans，与前人的研究结果相一致[57]。 有文献曾报道尖孢镰刀菌黏团专化型F.oxysporum f.sp. conglutinans的寄主范围十分广泛，不仅可以侵染大多数十字花科作物，还能侵染茄科、葫芦科、豆科、菊科、旋花科、伞形科及百合科等主要蔬菜作物，并使其成为无症带菌的隐性寄主[3，5，1819]。而甘肃定西是西北最大的高原夏菜产地之一，蔬菜品种多，种植面积广，因此尖孢镰刀菌黏团专化型F.oxysporum f.sp. conglutinans不仅会对当地甘蓝的生产造成严重的影响，也会成为其他蔬菜生产的潜在隐患。本研究结果为当地甘蓝枯萎病的防治奠定了可靠的理论基础。
参考文献
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（责任编辑：杨明丽）