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【摘要】目的：验证双滤膜过滤方法消除供试液抑菌活性的有效性，探讨药品微生物限度检查中建立双滤膜过滤方法的可行性。方法：将枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、黑曲霉以及白色念球菌作为挑战菌，以培养基稀释法和离心沉淀法作为对照方法，双滤膜过滤方法作为实验组，考察双滤膜过滤法的精密度、准确度、定量限等。结果：利用双滤膜过滤法在准确度、精密度、定量限等检测方面的结果优于或与现行的中国药典收载的方法持平。结论：利用双滤膜过滤方法处理供试品的过程符合中国药典微生物限度检查法的相关规定，结果有效，双滤膜过滤方法可以用于药品微生物限度检查。
【关键词】双滤膜过滤法；药品；微生物限度检查
【中图分类号】R-1 【文献标识码】B 【文章编号】1671-8801（2015）01-0337-02
在药品微生物限度检查中，片剂、栓剂以及膏剂等供试液中会含有不溶性残渣以及附加剂等，直接利用薄膜过滤法会造成滤膜堵塞问题[1]。而采用离心取上清液的方法，虽然能解决以上问题，然而，此法影响了微生物的回收率，较易造成数据结果的失真。双滤膜过滤方法能够有效地解决上述问题，下文就对该法在药品微生物限度检查中的应用进行分析。
1.一般资料
将枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、黑曲霉以及白色念球菌作为挑战菌，以山东三九药业有限公司生产的复方丹参片作为供试品，同时提供玫瑰红钠琼脂、营养琼脂以及胆盐乳糖三种培养基，采用YT—X303型微生物限度检查仪进行检测。双滤膜中A膜孔径20～30μm，直径85mm，B滤膜孔径≤0.45μm，直径0.75mm。将复方丹参片作为研究对象，双滤膜过滤方法作为实验组，霉菌和酵母菌计数验证采用培养基稀释法作为对照，细菌计数验证采用离心沉淀法加薄膜过滤法作为对照。取10g复方丹参片，加100ml的pH为7.0的无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液，搅拌均匀，将其作为1：10的供试液。取枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、黑曲霉以及白色念球菌，按药典收载的方法制成103～104cfu·mL-1的孢子悬液或者菌悬液。每种挑战菌制备10个菌浓度，测定方法为平皿法。
2.方法与结果
2.1准确度实验
2.1.1准确度实验方法
取1000mL的1：10供试液，均等分成10组，对应的加入10种浓度的实验菌各1mL，将其充分混匀。将供试液中黑曲霉的最终均浓度控制在0～100cfu·mL-1，枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念球菌的最终菌浓度控制在0～300cfu·mL-1。
實验组利用双滤膜过滤法：取1mL上述已接种实验菌的供试液，用100mL的稀释液进行稀释，用100mL的冲洗液冲洗A滤膜，取下A滤膜，再用100mL的冲洗液冲洗B滤膜，取下B滤膜接种到培养基上培养。
对照组根据菌的种类采用不同的培养方法。
培养基稀释法：用作酵母菌和霉菌对照。取2mL上述已接种试验菌的供试液，每1mL供试液均等地注入5个平皿中，按照药典收载的方法进行培养。
离心沉淀联合薄膜过滤法：用作细菌对照。取10mL上述已接种试验菌的供试液，用500r·min-1的速度离心3min，取上清液，按照薄膜过滤法进行操作。
2.1..2准确度实验结果
统计每种挑战菌在实验组和对照组之间的菌液浓度差异。结果：枯草芽孢杆菌10组平均回收率为93%，对照组分别为63%；实验组双滤膜过滤法实验菌回收率高于对照组离心沉淀联合薄膜过滤法，差异显著P<0.05，具有统计学意义。实验组对霉菌的回收率与对照组之间的差异不明显，不具有统计学意义。
2.2精密度实验
2.2.1精密度实验方法
利用上述5种实验菌，按照准确度的操作方法，对每个浓度的菌悬液进行10次的重复测量，利用统计学方法，处理实验数据。
2.2.2精密度实验结果
统计学检验结果表明，精密度方面，实验组与对照组之间的差异不显著，P>0.05，不具有统计学意义。双滤膜过滤法与培养基稀释法、离心沉淀联合薄膜过滤法在精密度方面的差异不明显。
2.3定量限实验
2.3.1定量限实验方法
取4000mL的1：10供试液，均匀分成40组，将大肠埃希菌作为实验菌，向40组供试液中加入1mL不同浓度的大肠埃希菌，为使微生物均匀分散，充分震荡试管。最终的供试液菌浓度≤10cfu·mL-1，分别利用双滤膜过滤法和离心沉淀联合薄膜过滤法处理供试液，将其作为c组；双滤膜过滤法实验组，随机抽取15个样本，作为a组，将A、B滤膜接种到100mL的胆盐乳糖培养基中；随机抽取25个样本，作为b组，只将B滤膜接种到100mL的胆盐乳糖培养基中。利用分割法分析a、b、c三组的检验结构是否存在差异。
2.3.2定量限实验结果
经过统计学分析，a、b组之间无差别，说明A滤膜不会对双滤膜过滤法的定量限造成显著性的影响；c组和a、b两组之间的差异性显著，说明双滤膜过滤法定量限高于离心沉淀联合薄膜过滤法。
3.讨论
双滤膜过滤法中的使用的A滤膜，当用于真菌过滤时，其孔径要应该大于30μm，用于细菌过滤时，其孔径应大于20μm[2]。对于较为粘稠的供试液，使用双滤膜过滤法时，应采用少量多次的方式，有利于避免A滤膜发生堵塞[3]。本研究双滤膜过滤法使用的B滤膜的直径为75mm，高于药典建议的50mm，因此，单张滤膜微生物的承载量较大。
本实验表明，采用双滤膜过滤方法处理供试品，准确度、精密度以及定量限等方面的检测结果优于或与现行药典收载的实验方法相持平。
综上所述，利用双滤膜过滤方法处理供试品的过程符合中国药典微生物限度检查法的相关规定，结果有效，双滤膜过滤方法可以用于药品微生物限度检查。
参考文献：
[1]李佳宁.影响微生物限度检查方法验证结果的若干因素分析[J].中国药业，2011，7（09）：22-23
[2]袁林娜，宋勤.微生物限度检查法中低速离心法回收细菌、真菌试验方法的研究[J].药物分析杂志，2011，1（10）：36-37
[3]冯慰民，付汶.浅析我国药品微生物限度检查[J].儿科药学杂志，2011，9（02）：45-46
【关键词】双滤膜过滤法；药品；微生物限度检查
【中图分类号】R-1 【文献标识码】B 【文章编号】1671-8801（2015）01-0337-02
在药品微生物限度检查中，片剂、栓剂以及膏剂等供试液中会含有不溶性残渣以及附加剂等，直接利用薄膜过滤法会造成滤膜堵塞问题[1]。而采用离心取上清液的方法，虽然能解决以上问题，然而，此法影响了微生物的回收率，较易造成数据结果的失真。双滤膜过滤方法能够有效地解决上述问题，下文就对该法在药品微生物限度检查中的应用进行分析。
1.一般资料
将枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、黑曲霉以及白色念球菌作为挑战菌，以山东三九药业有限公司生产的复方丹参片作为供试品，同时提供玫瑰红钠琼脂、营养琼脂以及胆盐乳糖三种培养基，采用YT—X303型微生物限度检查仪进行检测。双滤膜中A膜孔径20～30μm，直径85mm，B滤膜孔径≤0.45μm，直径0.75mm。将复方丹参片作为研究对象，双滤膜过滤方法作为实验组，霉菌和酵母菌计数验证采用培养基稀释法作为对照，细菌计数验证采用离心沉淀法加薄膜过滤法作为对照。取10g复方丹参片，加100ml的pH为7.0的无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液，搅拌均匀，将其作为1：10的供试液。取枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、黑曲霉以及白色念球菌，按药典收载的方法制成103～104cfu·mL-1的孢子悬液或者菌悬液。每种挑战菌制备10个菌浓度，测定方法为平皿法。
2.方法与结果
2.1准确度实验
2.1.1准确度实验方法
取1000mL的1：10供试液，均等分成10组，对应的加入10种浓度的实验菌各1mL，将其充分混匀。将供试液中黑曲霉的最终均浓度控制在0～100cfu·mL-1，枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念球菌的最终菌浓度控制在0～300cfu·mL-1。
實验组利用双滤膜过滤法：取1mL上述已接种实验菌的供试液，用100mL的稀释液进行稀释，用100mL的冲洗液冲洗A滤膜，取下A滤膜，再用100mL的冲洗液冲洗B滤膜，取下B滤膜接种到培养基上培养。
对照组根据菌的种类采用不同的培养方法。
培养基稀释法：用作酵母菌和霉菌对照。取2mL上述已接种试验菌的供试液，每1mL供试液均等地注入5个平皿中，按照药典收载的方法进行培养。
离心沉淀联合薄膜过滤法：用作细菌对照。取10mL上述已接种试验菌的供试液，用500r·min-1的速度离心3min，取上清液，按照薄膜过滤法进行操作。
2.1..2准确度实验结果
统计每种挑战菌在实验组和对照组之间的菌液浓度差异。结果：枯草芽孢杆菌10组平均回收率为93%，对照组分别为63%；实验组双滤膜过滤法实验菌回收率高于对照组离心沉淀联合薄膜过滤法，差异显著P<0.05，具有统计学意义。实验组对霉菌的回收率与对照组之间的差异不明显，不具有统计学意义。
2.2精密度实验
2.2.1精密度实验方法
利用上述5种实验菌，按照准确度的操作方法，对每个浓度的菌悬液进行10次的重复测量，利用统计学方法，处理实验数据。
2.2.2精密度实验结果
统计学检验结果表明，精密度方面，实验组与对照组之间的差异不显著，P>0.05，不具有统计学意义。双滤膜过滤法与培养基稀释法、离心沉淀联合薄膜过滤法在精密度方面的差异不明显。
2.3定量限实验
2.3.1定量限实验方法
取4000mL的1：10供试液，均匀分成40组，将大肠埃希菌作为实验菌，向40组供试液中加入1mL不同浓度的大肠埃希菌，为使微生物均匀分散，充分震荡试管。最终的供试液菌浓度≤10cfu·mL-1，分别利用双滤膜过滤法和离心沉淀联合薄膜过滤法处理供试液，将其作为c组；双滤膜过滤法实验组，随机抽取15个样本，作为a组，将A、B滤膜接种到100mL的胆盐乳糖培养基中；随机抽取25个样本，作为b组，只将B滤膜接种到100mL的胆盐乳糖培养基中。利用分割法分析a、b、c三组的检验结构是否存在差异。
2.3.2定量限实验结果
经过统计学分析，a、b组之间无差别，说明A滤膜不会对双滤膜过滤法的定量限造成显著性的影响；c组和a、b两组之间的差异性显著，说明双滤膜过滤法定量限高于离心沉淀联合薄膜过滤法。
3.讨论
双滤膜过滤法中的使用的A滤膜，当用于真菌过滤时，其孔径要应该大于30μm，用于细菌过滤时，其孔径应大于20μm[2]。对于较为粘稠的供试液，使用双滤膜过滤法时，应采用少量多次的方式，有利于避免A滤膜发生堵塞[3]。本研究双滤膜过滤法使用的B滤膜的直径为75mm，高于药典建议的50mm，因此，单张滤膜微生物的承载量较大。
本实验表明，采用双滤膜过滤方法处理供试品，准确度、精密度以及定量限等方面的检测结果优于或与现行药典收载的实验方法相持平。
综上所述，利用双滤膜过滤方法处理供试品的过程符合中国药典微生物限度检查法的相关规定，结果有效，双滤膜过滤方法可以用于药品微生物限度检查。
参考文献：
[1]李佳宁.影响微生物限度检查方法验证结果的若干因素分析[J].中国药业，2011，7（09）：22-23
[2]袁林娜，宋勤.微生物限度检查法中低速离心法回收细菌、真菌试验方法的研究[J].药物分析杂志，2011，1（10）：36-37
[3]冯慰民，付汶.浅析我国药品微生物限度检查[J].儿科药学杂志，2011，9（02）：45-46