【摘 要】
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目的 建立先天性失氯性腹泻(CCD)相关SLC26A3 c.392C>G(p.P131R)突变体细胞模型并初步研究其生物学功能.方法 根据GenBank中SLC26A3基因序列,设计特异性识别SLC26A3基因392位
【机 构】
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空军军医大学/第四军医大学唐都医院儿科,陕西 西安,710038
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目的 建立先天性失氯性腹泻(CCD)相关SLC26A3 c.392C>G(p.P131R)突变体细胞模型并初步研究其生物学功能.方法 根据GenBank中SLC26A3基因序列,设计特异性识别SLC26A3基因392位点的上下游单导RNA(sgRNA),与酶切后的pSpCas9-puro载体混合构建真核重组表达质粒(pSpCas9-SLC26A3).将重组质粒和供体DNA模板单链DNA寡核苷酸(ssODN)共转染至Caco-2细胞,采用Taqman基因型分析和Sanger测序鉴定SLC26A3 c.392C>G(p.P131R)在Caco-2细胞中的表达.以野生型Caco-2细胞为正常对照组,以成功表达SLC26A3 c.392C>G(p.P131R)的Caco-2细胞为P131R组,两组细胞分别经100 ng/mL TNF-α诱导并命名为TNF-α组和TNF-α+P131R组,通过电-细胞-基质阻抗传感(ECIS)分析检测上述4组肠上皮细胞单层屏障功能的变化;通过Western blot检测正常对照组和P131R组细胞SLC26A3蛋白的表达变化.结果 成功构建了真核重组表达质粒(pSpCas9-SLC26A3).Taqman基因型分析和Sanger测序均验证SLC26A3 c.392C>G(p.P131R)表达的Caco-2细胞模型构建成功.ECIS分析显示:与正常对照组相比,P131R组肠上皮细胞单层通透性明显增加(P<0.05);同时P131R组细胞经TNF-α诱导后的细胞膜通透性增加更为显著(PG(p.P131R)可引起SLC26A3蛋白表达下降,从而增加肠上皮细胞单层通透性,引起相关腹泻的发生.
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