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摘要：【目的】分离纯化鲍鱼内脏多糖（Abalone viscera polysaccharide，AVP），并评价其抗氧化活性，为AVP的高值化利用提供参考依据。【方法】以鲍鱼内脏为原料，采用酶法提取并初步纯化出AVP，测定其DPPH自由基清除率、羟自由基（OH自由基）清除率和还原力3个抗氧化指标，评价AVP抗氧化能力;同时用葡聚糖凝胶G-100柱层析分离AVP，并对分离出的组分进行抗氧化能力比较。【结果】AVP质量浓度在1～10 mg/mL时，DPPH自由基清除率线性方程为y=9.715x+1.0182（R2=0.9958），半抑制浓度（IC50）為5.04 mg/mL;OH自由基清除率线性方程为y=6.2778x-8.5275（R2=0.9603），IC50为9.32 mg/mL;还原力线性方程为y=0.0782x+0.0045（R2=0.9989），A700，0.2为2.50 mg/mL。AVP具有一定的抗氧化能力，但与抗坏血酸（Vc）相比，其抗氧化能力较弱。AVP经葡聚糖凝胶G-100柱层析可分离出两个组分（AVP1和AVP2），AVP1和AVP2均具有一定的抗氧化活性，且AVP1抗氧化能力强于AVP2。【结论】通过葡聚糖凝胶柱层析可从AVP中有效分离出AVP1和AVP2两个组分，其中AVP1的抗氧化能力更强，在抗氧化添加剂及保健品等领域具有较好的开发利用前景。
关键词： 鲍鱼内脏;分离纯化;多糖;抗氧化
中图分类号： S986.2;TS254.1 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）02-0372-06
Abstract：【Objective】Abalone viscera polysaccharide（AVP） was isolated and purified， then its antioxidant activity was evaluated. It provided technical support for high-value utilization of AVP. 【Method】In this research， the abalone viscera was used as experimental material to extract and purify AVP by enzymatic extraction and preliminary purification.The three antioxidant indexes， namely DPPH radical scavenging rate， hydroxyl radical（OH radical） scavenging rate and reducing power of AVP were determined， and the antioxidant capacity of AVP was evaluated. Meanwhile， the AVP was isolated by glucose gel G-100 column layer and the antioxidant abilities of isolated fractions were studied and compared. 【Result】The experimental results showed that the mass concentration of AVP was in the range of 1-10 mg/mL， and the linear equation of DPPH radical scavenging rate was y=9.715x+1.0182（R2=0.9958）， half-inhibitory concentration（IC50） value was 5.04 mg/mL. The linear equation of OH radical scavenging rate was y=6.2778x-8.5275（R2=0.9603）， IC50 value was 9.32 mg/mL. The linear equation of reducing power was y=0.0782x+0.0045（R2=0.9989）， and the value of A700，0.2 was 2.50 mg/mL. AVP could be separated into two components（AVP1 and AVP2） by G-100 column chromatography， both AVP1 and AVP2 had certain antioxidant activity， and AVP1 had higher antioxidant capacity than AVP2. 【Conclusion】AVP could be separated into AVP1 and AVP2 by sephadex column chromatography. AVP1 had higher antioxidant activity and therefore enjoys a good prospect of development and utilization in the fields of antioxidant additive and health products.
Key words： abalone viscera; separation and purification; polysaccharide; antioxidation
0 引言 【研究意义】鲍鱼属软体动物门（Mollusca）腹足纲（Gastropoda）前鳃亚纲（Prosobranchia）原始腹足目（Archaeogastropoda）鲍科（Haliotidae）鲍属（Halio-tis）（李太武等，2004），其营养丰富、口感佳，具有很高的食用价值和药用价值，深受广大消费者喜爱。然而，占鲍鱼质量五分之一的内脏在加工过程中仅有少部分被制成鲍鱼调味品等工艺产品（郑瑞生等，2016），多数内脏被当作废弃物直接丢弃，造成极大浪费。鲍鱼内脏中富含多糖，王姣等（2015）通过木瓜蛋白酶与胰蛋白酶进行复合酶解提取，鲍鱼内脏多糖（Abalone viscera polysaccharide，AVP）提取率可達16.58%。随着医药学的发展与研究，人们发现肿瘤、糖尿病、心脏病、肾病等近百种疾病的产生和发展都与氧化有关（凌关庭，2004）。由于人工合成的抗氧化剂具有损伤肝脏并诱发肿瘤等缺点（王莅莎等，2008），因此，寻找高效安全的抗氧化剂具有重要意义，其中天然抗氧化剂因其安全、无毒、高效的特点而越来越受大众的认可（吴静等，2016）。因此，研究AVP的抗氧化性，对提高鲍鱼资源综合利用率和鲍鱼加工产品的附加值均具有重要意义，同时为研发天然抗氧化剂提供新途径。【前人研究进展】多糖作为一种高分子聚合物，在生物体内具有丰富多样的生物功能和活性作用，如调节免疫、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、降血压、降血糖、降血脂等（Zhu et al.，2010，2011;Li et al.，2011;Wang et al.，2014;马军等，2017），已在食品和药品中得到广泛应用。目前对鲍鱼内脏的生物活性功能研究已有不少报道。Sun等（2010）对AVP研究发现，40 mg/kg剂量的AVP在抗肿瘤和提供机体免疫能力上效果显著;罗晓航（2012）通过高压脉冲电场结合酶法提取了鲍鱼脏器粗多糖，并发现其具有抗氧化活性;余鑫（2012）对鲍鱼脏器粗多糖的提取工艺和降血脂活性进行了研究，发现其对因高脂饮食所导致的小鼠血脂升高有显著抑制作用;邹文文（2013）通过Sevag法及DEAE-52纤维素阴离子交换层析对鲍鱼脏器粗多糖进行分离纯化，得出3个组分，并发现这3个组分均具有一定的体外抗氧化能力;叶丹榕等（2014）研究皱纹盘鲍内脏提取的粗多糖对小鼠的降血糖作用，发现其能够提高糖尿病小鼠体内抗氧化酶活性。【本研究切入点】虽然已有对鲍鱼脏器粗多糖进行层析和抗氧化活性的研究报道（邹文文，2013），但其先以DEAE-52纤维素阴离子交换层析得到3个组分，再用葡聚糖凝胶G-100鉴定单一峰，且未进行粗多糖和多糖的抗氧化能力比较;而本研究直接用葡聚糖凝胶G-100对鲍鱼内脏粗多糖（AVCP）进行分离纯化，并将粗多糖与其多糖的抗氧化能力进行对比分析，找出其抗氧化优势组分。【拟解决的关键问题】将酶法提取的AVCP通过葡聚糖凝胶G-100柱层析分离纯化，然后对分离纯化后的AVP还原力、DPPH自由基清除率及羟自由基（OH自由基）清除率进行测定，以抗坏血酸（Vc）为对比，评价AVP抗氧化能力，为鲍鱼内脏的开发利用提供参考依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
鲍鱼内脏取自福建连江产杂交鲍，经组织捣碎机捣碎混匀制成样品，于-20 ℃下冷冻保藏。磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、无水乙醇、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、邻二氮菲、Vc、硫酸亚铁、Tris、过氧化氢、盐酸和邻苯三酚等均为国产分析纯，购自广州左克生物科技发展有限公司;试验用水为蒸馏水和超纯水。主要仪器设备：HH-4数显恒温水浴锅（常州澳华仪器有限公司）、Sigam 3K30冷冻离心机（德国Sigma公司）、EYELA N-1000旋转蒸发仪（日本Eyela公司）、ALPHA 1-4冷冻干燥机（德国Christ公司）、Sunrise-basic Tecan吸光酶标仪（瑞士Tecan公司）、超声波清洗仪（德国Elma公司）。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 AVCP提取流程 鲍鱼内脏→冻干→粉碎过40目筛→鲍鱼内脏粉→调节料液比1∶49（g/mL，下同）→调节pH 8.6→胰蛋白酶加酶量2.1%→酶解温度37 ℃，酶解时间2 h→沸水灭酶10 min→冷却，调中性→离心（4500 r/min）10 min→加上清液3倍体积的95%乙醇→醇沉过夜→离心既得（陈胜军等，2018）。
1. 2. 2 AVP分离纯化流程 AVCP→去色素（丙酮、乙醇）→脱蛋白（胃蛋白酶解）→透析→反复冻融→冷冻干燥→初步纯化的AVP→葡聚糖凝胶G-100柱层析→0.9%氯化钠溶液洗脱→收集组分（AVP1和AVP2）。
1. 2. 3 脱蛋白 利用胃蛋白酶进行酶解，酶解条件为料液比1∶40、加酶量0.2%、pH 3.0、温度37 ℃、水解时间3 h，酶解工艺参考1.2.1，从而进一步纯化AVCP。
1. 2. 4 透析 将脱蛋白后的多糖配制成一定质量浓度的多糖溶液，在截留分子量5000 Da的透析袋内用超纯水透析24 h，每隔3 h换一次水。
1. 2. 5 冻融 将透析后的多糖溶液保存在-20 ℃冷冻冰箱中24 h，取出后放置室温缓慢融化，4 ℃高速（8000 r/min）离心20 min，除去沉淀。反复冻融多次，直到离心后无沉淀即可，取出溶液冷冻干燥后即为初步纯化的AVP。
1. 2. 6 葡聚糖凝胶G-100柱层析 将初步纯化的AVP配制成2 mg/mL多糖溶液，用葡聚糖凝胶G-100柱层析分离并收集，0.9%氯化钠溶液进行洗脱，流速0.5 mL/min，每6 min收集1管，共收集80管;用苯酚硫酸法检验，得出洗脱峰。
1. 2. 7 DPPH自由基清除率测定 参考马赛蕊等（2012）和陈义勇等（2013）的方法，取1.0 mL样液，加入1.0 mL 0.15 mmol/L DPPH溶液（用95%乙醇溶解），摇匀后室温避光30 min，在517 nm波长处测定吸光值（Ai）;空白组为1.0 mL样液加入1.0 mL 95%乙醇溶液混合，室温避光30 min，在517 nm波长处测定吸光值（Aj）;对照组为1.0 mL DPPH溶液加入1.0 mL 95%乙醇，室温避光30 min，在517 nm波长处测定吸光值（A0）。按下式计算DPPH自由基清除率： DPPH自由基清除率（%）= [1-Ai-AjA0] ×100
1. 2. 8 OH自由基清除率测定 参考马赛蕊等（2012）的方法，取0.3 mL邻二氮菲·无水乙醇溶液，加入0.2 mL磷酸盐缓冲液和0.3 mL硫酸亚铁溶液，然后加入样液1.0 mL混匀后，加入0.2 mL过氧化氢溶液摇匀，在37 ℃下水浴60 min，于510 nm波长处测其吸光值（AS）;以1.2 mL蒸馏水代替样品和过氧化氢溶液进行相同操作，测其吸光值（A0）;以1.0 mL蒸馏水代替样品进行相同操作，测其吸光值（Ad）。清除率按下式进行计算：
OH自由基清除率（%）=[As-AdA0] ×100
注意操作中每加入一种试剂后要立即摇匀，否则会使局部颜色过深而影响试验结果的准确性，且过氧化氢最后加入。加样情况如表1所示。
1. 2. 9 还原力测定 取样液1.0 mL，加入1.0 mL 0.2 mol/L磷酸缓冲液（pH 6.6）和1.0 mL 1%铁氰化钾溶液混匀，在50 ℃水浴锅内保温20 min，加入1.0 mL 10%三氯乙酸溶液，振荡混匀后4 ℃下10000 r/mim离心10 min，吸取上清液1.0 mL，加入1.0 mL去离子水和0.2 mL 0.1%三氯化铁溶液，振荡混匀后50 ℃水浴保温10 min，观察溶液由黄色变为蓝色后，在700 nm波长处测其吸光值。以蒸馏水代替多糖样品作为空白对照调零。
1. 2. 10 AVP抗氧化能力测定 将AVP分别配制成1、2、4、6、8和10 mg/mL溶液，通过测定AVP的DPPH自由基清除率、OH自由基清除率及还原力3个指标，与对应浓度相差100倍的Vc进行对比，得出AVP的抗氧化能力。
1. 3 統计分析
采用SPSS 20.0进行差异显著性分析，运用Design Expert 8.0.6对试验数据进行分析。
2 结果与分析
2. 1 初步纯化的AVP抗氧化活性
2. 1. 1 AVP的DPPH自由基清除能力 DPPH是一种很稳定的自由基，由图1可知，AVP质量浓度在1～10 mg/mL范围内，其对DPPH自由基的清除率呈现一定的线性关系，通过拟合得出线性方程为y=9.715x+1.0182（R2=0.9958），计算得出AVP对DPPH自由基的半抑制浓度（IC50）为5.04 mg/mL;AVP对DPPH自由基具有清除作用，且10 mg/mL的清除率可达97.39%，但与Vc（图2）相比，其对DPPH自由基清除能力仍较弱。
2. 1. 2 AVP的OH自由基清除能力 OH自由基是毒性最强的一种活性氧自由基，对生物机体具有很强的破坏作用。由图3可知，AVP质量浓度在1～10 mg/mL范围内，其对OH自由基的清除率呈现一定的线性关系，通过拟合得出线性方程为y=6.2778x-8.5275（R2=0.9603），计算得出AVP对OH自由基的IC50为9.32 mg/mL;AVP对OH自由基具有清除作用，但与Vc（图4）相比，其对OH自由基清除能力仍较弱。
2. 1. 3 AVP的还原能力 由图5可知，AVP质量浓度在1～10 mg/mL范围内，其还原能力呈现一定的线性关系，通过拟合得出线性方程为y=0.0782x+0.0045（R2=0.9989）。以A700，0.2作为指标比较还原能力，即A700为0.2时对应的溶液质量浓度，由图5和图6可知AVP和Vc的A700，0.2分别为2.50和0.02 mg/mL，说明，AVP具有还原能力，但与Vc相比，其还原能力较弱。
2. 2 AVP1和AVP2的抗氧化活性
2. 2. 1 葡聚糖凝胶G-100柱层析结果 通过苯酚硫酸法测定吸光值得到洗脱曲线（图7），从图7可看出，AVP分离出两个组分（AVP1和AVP2），收集峰高部分进行抗氧化活性研究。
2. 2. 2 AVP1和AVP2的抗氧化活性 由表2可知，AVP1和AVP2的DPPH自由基清除率、OH自由基清除率和还原力3个指标均高于AVP，可能是由于AVP中含有杂质且不同组分间互相影响，而降低其抗氧化能力。AVP1和AVP2均具有一定的抗氧化活性，在前面试验中已知DPPH自由基清除率、OH自由基清除率和还原力3个指标与多糖质量浓度均呈线性关系，AVP1质量浓度低于AVP2质量浓度，但其DPPH自由基和OH自由基清除率均高于AVP2，还原力与AVP2接近，说明AVP1的抗氧化能力高于AVP2。
3 讨论
多糖与机体生命的多种生理功能密切相关，具有多种生物活性功能。适量的自由基对细胞具有促进分裂、生长及消炎等多种活性功能，但过多或清除过慢会使许多生物大分子受到攻击，从而加速机体衰老（Guerra Dore et al.，2013;刘欢等，2018）。为了获取天然安全的抗氧化物质，王莅莎等（2008）通过酶法提取鲍鱼脏器多糖并进行分离纯化，发现鲍鱼脏器多糖具有一定的抗氧化能力，但未发现其哪一种组分更优;罗晓航（2012）对皱纹盘鲍脏器粗多糖的抗氧化活性研究发现，鲍鱼脏器粗多糖具有一定的抗氧化活性。本研究采用酶法提取并通过葡聚糖凝胶G-100柱层析分离纯化出AVP，并对其还原力、DPPH自由基清除率及OH自由基清除率进行测定，发现AVP质量浓度在1～10 mg/mL内对DPPH自由基和OH自由基的清除能力均呈现一定的线性关系，IC50分别为5.04和9.32 mg/mL;还原能力也呈现一定的线性关系，A700，0.2为2.50 mg/mL。通过3种指标考察发现AVP具有一定的抗氧化能力，但与Vc相比，其抗氧化能力较弱。
葡聚糖凝胶G-100柱层析是通过分子量的大小进行分离纯化，其分离范围为4000～150000 Da，本研究在透析时使用5000 Da的透析袋，因此选用G-100更有利于多糖组分的分离。AVP经葡聚糖凝胶G-100柱层析可分离出两个不同分子量的组分（AVP1和AVP2）;通过对3个抗氧化指标的试验发现，AVP1和AVP2均具有一定的抗氧化能力，且AVP1的抗氧化能力高于AVP2，而两个组分的抗氧化能力均高于AVP。这可能是由于粗多糖中AVP1和AVP2互相影响，或有其他物质影响其抗氧化活性，导致AVP的抗氧化能力低于AVP1和AVP2。为了深入研究其抗氧化活性，下一步可对AVP1的结构、性状及作用机理进行探究。 4 结论
通过葡聚糖凝胶柱层析可从AVP中有效分离出两个组分（AVP1和AVP2），其中AVP1的抗氧化能力更强，在抗氧化添加剂及保健品等领域具有较好的开发利用前景。
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（责任编辑 罗 丽）
关键词： 鲍鱼内脏;分离纯化;多糖;抗氧化
中图分类号： S986.2;TS254.1 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）02-0372-06
Abstract：【Objective】Abalone viscera polysaccharide（AVP） was isolated and purified， then its antioxidant activity was evaluated. It provided technical support for high-value utilization of AVP. 【Method】In this research， the abalone viscera was used as experimental material to extract and purify AVP by enzymatic extraction and preliminary purification.The three antioxidant indexes， namely DPPH radical scavenging rate， hydroxyl radical（OH radical） scavenging rate and reducing power of AVP were determined， and the antioxidant capacity of AVP was evaluated. Meanwhile， the AVP was isolated by glucose gel G-100 column layer and the antioxidant abilities of isolated fractions were studied and compared. 【Result】The experimental results showed that the mass concentration of AVP was in the range of 1-10 mg/mL， and the linear equation of DPPH radical scavenging rate was y=9.715x+1.0182（R2=0.9958）， half-inhibitory concentration（IC50） value was 5.04 mg/mL. The linear equation of OH radical scavenging rate was y=6.2778x-8.5275（R2=0.9603）， IC50 value was 9.32 mg/mL. The linear equation of reducing power was y=0.0782x+0.0045（R2=0.9989）， and the value of A700，0.2 was 2.50 mg/mL. AVP could be separated into two components（AVP1 and AVP2） by G-100 column chromatography， both AVP1 and AVP2 had certain antioxidant activity， and AVP1 had higher antioxidant capacity than AVP2. 【Conclusion】AVP could be separated into AVP1 and AVP2 by sephadex column chromatography. AVP1 had higher antioxidant activity and therefore enjoys a good prospect of development and utilization in the fields of antioxidant additive and health products.
Key words： abalone viscera; separation and purification; polysaccharide; antioxidation
0 引言 【研究意义】鲍鱼属软体动物门（Mollusca）腹足纲（Gastropoda）前鳃亚纲（Prosobranchia）原始腹足目（Archaeogastropoda）鲍科（Haliotidae）鲍属（Halio-tis）（李太武等，2004），其营养丰富、口感佳，具有很高的食用价值和药用价值，深受广大消费者喜爱。然而，占鲍鱼质量五分之一的内脏在加工过程中仅有少部分被制成鲍鱼调味品等工艺产品（郑瑞生等，2016），多数内脏被当作废弃物直接丢弃，造成极大浪费。鲍鱼内脏中富含多糖，王姣等（2015）通过木瓜蛋白酶与胰蛋白酶进行复合酶解提取，鲍鱼内脏多糖（Abalone viscera polysaccharide，AVP）提取率可達16.58%。随着医药学的发展与研究，人们发现肿瘤、糖尿病、心脏病、肾病等近百种疾病的产生和发展都与氧化有关（凌关庭，2004）。由于人工合成的抗氧化剂具有损伤肝脏并诱发肿瘤等缺点（王莅莎等，2008），因此，寻找高效安全的抗氧化剂具有重要意义，其中天然抗氧化剂因其安全、无毒、高效的特点而越来越受大众的认可（吴静等，2016）。因此，研究AVP的抗氧化性，对提高鲍鱼资源综合利用率和鲍鱼加工产品的附加值均具有重要意义，同时为研发天然抗氧化剂提供新途径。【前人研究进展】多糖作为一种高分子聚合物，在生物体内具有丰富多样的生物功能和活性作用，如调节免疫、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、降血压、降血糖、降血脂等（Zhu et al.，2010，2011;Li et al.，2011;Wang et al.，2014;马军等，2017），已在食品和药品中得到广泛应用。目前对鲍鱼内脏的生物活性功能研究已有不少报道。Sun等（2010）对AVP研究发现，40 mg/kg剂量的AVP在抗肿瘤和提供机体免疫能力上效果显著;罗晓航（2012）通过高压脉冲电场结合酶法提取了鲍鱼脏器粗多糖，并发现其具有抗氧化活性;余鑫（2012）对鲍鱼脏器粗多糖的提取工艺和降血脂活性进行了研究，发现其对因高脂饮食所导致的小鼠血脂升高有显著抑制作用;邹文文（2013）通过Sevag法及DEAE-52纤维素阴离子交换层析对鲍鱼脏器粗多糖进行分离纯化，得出3个组分，并发现这3个组分均具有一定的体外抗氧化能力;叶丹榕等（2014）研究皱纹盘鲍内脏提取的粗多糖对小鼠的降血糖作用，发现其能够提高糖尿病小鼠体内抗氧化酶活性。【本研究切入点】虽然已有对鲍鱼脏器粗多糖进行层析和抗氧化活性的研究报道（邹文文，2013），但其先以DEAE-52纤维素阴离子交换层析得到3个组分，再用葡聚糖凝胶G-100鉴定单一峰，且未进行粗多糖和多糖的抗氧化能力比较;而本研究直接用葡聚糖凝胶G-100对鲍鱼内脏粗多糖（AVCP）进行分离纯化，并将粗多糖与其多糖的抗氧化能力进行对比分析，找出其抗氧化优势组分。【拟解决的关键问题】将酶法提取的AVCP通过葡聚糖凝胶G-100柱层析分离纯化，然后对分离纯化后的AVP还原力、DPPH自由基清除率及羟自由基（OH自由基）清除率进行测定，以抗坏血酸（Vc）为对比，评价AVP抗氧化能力，为鲍鱼内脏的开发利用提供参考依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
鲍鱼内脏取自福建连江产杂交鲍，经组织捣碎机捣碎混匀制成样品，于-20 ℃下冷冻保藏。磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、无水乙醇、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、邻二氮菲、Vc、硫酸亚铁、Tris、过氧化氢、盐酸和邻苯三酚等均为国产分析纯，购自广州左克生物科技发展有限公司;试验用水为蒸馏水和超纯水。主要仪器设备：HH-4数显恒温水浴锅（常州澳华仪器有限公司）、Sigam 3K30冷冻离心机（德国Sigma公司）、EYELA N-1000旋转蒸发仪（日本Eyela公司）、ALPHA 1-4冷冻干燥机（德国Christ公司）、Sunrise-basic Tecan吸光酶标仪（瑞士Tecan公司）、超声波清洗仪（德国Elma公司）。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 AVCP提取流程 鲍鱼内脏→冻干→粉碎过40目筛→鲍鱼内脏粉→调节料液比1∶49（g/mL，下同）→调节pH 8.6→胰蛋白酶加酶量2.1%→酶解温度37 ℃，酶解时间2 h→沸水灭酶10 min→冷却，调中性→离心（4500 r/min）10 min→加上清液3倍体积的95%乙醇→醇沉过夜→离心既得（陈胜军等，2018）。
1. 2. 2 AVP分离纯化流程 AVCP→去色素（丙酮、乙醇）→脱蛋白（胃蛋白酶解）→透析→反复冻融→冷冻干燥→初步纯化的AVP→葡聚糖凝胶G-100柱层析→0.9%氯化钠溶液洗脱→收集组分（AVP1和AVP2）。
1. 2. 3 脱蛋白 利用胃蛋白酶进行酶解，酶解条件为料液比1∶40、加酶量0.2%、pH 3.0、温度37 ℃、水解时间3 h，酶解工艺参考1.2.1，从而进一步纯化AVCP。
1. 2. 4 透析 将脱蛋白后的多糖配制成一定质量浓度的多糖溶液，在截留分子量5000 Da的透析袋内用超纯水透析24 h，每隔3 h换一次水。
1. 2. 5 冻融 将透析后的多糖溶液保存在-20 ℃冷冻冰箱中24 h，取出后放置室温缓慢融化，4 ℃高速（8000 r/min）离心20 min，除去沉淀。反复冻融多次，直到离心后无沉淀即可，取出溶液冷冻干燥后即为初步纯化的AVP。
1. 2. 6 葡聚糖凝胶G-100柱层析 将初步纯化的AVP配制成2 mg/mL多糖溶液，用葡聚糖凝胶G-100柱层析分离并收集，0.9%氯化钠溶液进行洗脱，流速0.5 mL/min，每6 min收集1管，共收集80管;用苯酚硫酸法检验，得出洗脱峰。
1. 2. 7 DPPH自由基清除率测定 参考马赛蕊等（2012）和陈义勇等（2013）的方法，取1.0 mL样液，加入1.0 mL 0.15 mmol/L DPPH溶液（用95%乙醇溶解），摇匀后室温避光30 min，在517 nm波长处测定吸光值（Ai）;空白组为1.0 mL样液加入1.0 mL 95%乙醇溶液混合，室温避光30 min，在517 nm波长处测定吸光值（Aj）;对照组为1.0 mL DPPH溶液加入1.0 mL 95%乙醇，室温避光30 min，在517 nm波长处测定吸光值（A0）。按下式计算DPPH自由基清除率： DPPH自由基清除率（%）= [1-Ai-AjA0] ×100
1. 2. 8 OH自由基清除率测定 参考马赛蕊等（2012）的方法，取0.3 mL邻二氮菲·无水乙醇溶液，加入0.2 mL磷酸盐缓冲液和0.3 mL硫酸亚铁溶液，然后加入样液1.0 mL混匀后，加入0.2 mL过氧化氢溶液摇匀，在37 ℃下水浴60 min，于510 nm波长处测其吸光值（AS）;以1.2 mL蒸馏水代替样品和过氧化氢溶液进行相同操作，测其吸光值（A0）;以1.0 mL蒸馏水代替样品进行相同操作，测其吸光值（Ad）。清除率按下式进行计算：
OH自由基清除率（%）=[As-AdA0] ×100
注意操作中每加入一种试剂后要立即摇匀，否则会使局部颜色过深而影响试验结果的准确性，且过氧化氢最后加入。加样情况如表1所示。
1. 2. 9 还原力测定 取样液1.0 mL，加入1.0 mL 0.2 mol/L磷酸缓冲液（pH 6.6）和1.0 mL 1%铁氰化钾溶液混匀，在50 ℃水浴锅内保温20 min，加入1.0 mL 10%三氯乙酸溶液，振荡混匀后4 ℃下10000 r/mim离心10 min，吸取上清液1.0 mL，加入1.0 mL去离子水和0.2 mL 0.1%三氯化铁溶液，振荡混匀后50 ℃水浴保温10 min，观察溶液由黄色变为蓝色后，在700 nm波长处测其吸光值。以蒸馏水代替多糖样品作为空白对照调零。
1. 2. 10 AVP抗氧化能力测定 将AVP分别配制成1、2、4、6、8和10 mg/mL溶液，通过测定AVP的DPPH自由基清除率、OH自由基清除率及还原力3个指标，与对应浓度相差100倍的Vc进行对比，得出AVP的抗氧化能力。
1. 3 統计分析
采用SPSS 20.0进行差异显著性分析，运用Design Expert 8.0.6对试验数据进行分析。
2 结果与分析
2. 1 初步纯化的AVP抗氧化活性
2. 1. 1 AVP的DPPH自由基清除能力 DPPH是一种很稳定的自由基，由图1可知，AVP质量浓度在1～10 mg/mL范围内，其对DPPH自由基的清除率呈现一定的线性关系，通过拟合得出线性方程为y=9.715x+1.0182（R2=0.9958），计算得出AVP对DPPH自由基的半抑制浓度（IC50）为5.04 mg/mL;AVP对DPPH自由基具有清除作用，且10 mg/mL的清除率可达97.39%，但与Vc（图2）相比，其对DPPH自由基清除能力仍较弱。
2. 1. 2 AVP的OH自由基清除能力 OH自由基是毒性最强的一种活性氧自由基，对生物机体具有很强的破坏作用。由图3可知，AVP质量浓度在1～10 mg/mL范围内，其对OH自由基的清除率呈现一定的线性关系，通过拟合得出线性方程为y=6.2778x-8.5275（R2=0.9603），计算得出AVP对OH自由基的IC50为9.32 mg/mL;AVP对OH自由基具有清除作用，但与Vc（图4）相比，其对OH自由基清除能力仍较弱。
2. 1. 3 AVP的还原能力 由图5可知，AVP质量浓度在1～10 mg/mL范围内，其还原能力呈现一定的线性关系，通过拟合得出线性方程为y=0.0782x+0.0045（R2=0.9989）。以A700，0.2作为指标比较还原能力，即A700为0.2时对应的溶液质量浓度，由图5和图6可知AVP和Vc的A700，0.2分别为2.50和0.02 mg/mL，说明，AVP具有还原能力，但与Vc相比，其还原能力较弱。
2. 2 AVP1和AVP2的抗氧化活性
2. 2. 1 葡聚糖凝胶G-100柱层析结果 通过苯酚硫酸法测定吸光值得到洗脱曲线（图7），从图7可看出，AVP分离出两个组分（AVP1和AVP2），收集峰高部分进行抗氧化活性研究。
2. 2. 2 AVP1和AVP2的抗氧化活性 由表2可知，AVP1和AVP2的DPPH自由基清除率、OH自由基清除率和还原力3个指标均高于AVP，可能是由于AVP中含有杂质且不同组分间互相影响，而降低其抗氧化能力。AVP1和AVP2均具有一定的抗氧化活性，在前面试验中已知DPPH自由基清除率、OH自由基清除率和还原力3个指标与多糖质量浓度均呈线性关系，AVP1质量浓度低于AVP2质量浓度，但其DPPH自由基和OH自由基清除率均高于AVP2，还原力与AVP2接近，说明AVP1的抗氧化能力高于AVP2。
3 讨论
多糖与机体生命的多种生理功能密切相关，具有多种生物活性功能。适量的自由基对细胞具有促进分裂、生长及消炎等多种活性功能，但过多或清除过慢会使许多生物大分子受到攻击，从而加速机体衰老（Guerra Dore et al.，2013;刘欢等，2018）。为了获取天然安全的抗氧化物质，王莅莎等（2008）通过酶法提取鲍鱼脏器多糖并进行分离纯化，发现鲍鱼脏器多糖具有一定的抗氧化能力，但未发现其哪一种组分更优;罗晓航（2012）对皱纹盘鲍脏器粗多糖的抗氧化活性研究发现，鲍鱼脏器粗多糖具有一定的抗氧化活性。本研究采用酶法提取并通过葡聚糖凝胶G-100柱层析分离纯化出AVP，并对其还原力、DPPH自由基清除率及OH自由基清除率进行测定，发现AVP质量浓度在1～10 mg/mL内对DPPH自由基和OH自由基的清除能力均呈现一定的线性关系，IC50分别为5.04和9.32 mg/mL;还原能力也呈现一定的线性关系，A700，0.2为2.50 mg/mL。通过3种指标考察发现AVP具有一定的抗氧化能力，但与Vc相比，其抗氧化能力较弱。
葡聚糖凝胶G-100柱层析是通过分子量的大小进行分离纯化，其分离范围为4000～150000 Da，本研究在透析时使用5000 Da的透析袋，因此选用G-100更有利于多糖组分的分离。AVP经葡聚糖凝胶G-100柱层析可分离出两个不同分子量的组分（AVP1和AVP2）;通过对3个抗氧化指标的试验发现，AVP1和AVP2均具有一定的抗氧化能力，且AVP1的抗氧化能力高于AVP2，而两个组分的抗氧化能力均高于AVP。这可能是由于粗多糖中AVP1和AVP2互相影响，或有其他物质影响其抗氧化活性，导致AVP的抗氧化能力低于AVP1和AVP2。为了深入研究其抗氧化活性，下一步可对AVP1的结构、性状及作用机理进行探究。 4 结论
通过葡聚糖凝胶柱层析可从AVP中有效分离出两个组分（AVP1和AVP2），其中AVP1的抗氧化能力更强，在抗氧化添加剂及保健品等领域具有较好的开发利用前景。
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（责任编辑 罗 丽）