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摘要 目的：研究不同浓度龙血素A对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、凋亡、迁移能力的影响以及对Col-I、Col-III、α-SMA、Bax、Caspase-3蛋白表达水平的影响。方法：1）不同浓度龙血素A作用于瘢痕疙瘩成纤维细胞，用CellTiter-Blue活力检测试验检测龙血素A对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的影响。2）流式细胞术检测龙血素A对瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡的影响。3）划痕实验检测龙血素A对瘢痕疙瘩成纤维细胞迁移的影响。4）Western-Blot测定龙血素A对瘢痕疙瘩成纤维细胞Col-I、Col-III、α-SMA、Bax、Caspase-3蛋白水平的影响。结果：龙血素A可抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、迁移并诱导其凋亡，同时减少COL-I、COL-III、α-SMA蛋白表达，并促进Bax、Caspase-3蛋白表达，并且均呈现剂量依赖性。结论：龙血素A可以调控瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖与凋亡的平衡、减少细胞外基质沉积，从而可能对KD发挥一定的治疗作用。
关键词 龙血素A;瘢痕疙瘩;成纤维细胞
Study on the Effects of Loureirin A on Keloid Fibroblast Growth Function
MA Hui1，ZHANG Runtian1，LI Hang2，HUANG Min1，CHEN Guangshan1，LIU Yang3，QU Tiange4，BAO Hailan5，ZHOU Lin1，ZHAO Yan1，DUAN Xingwu1，LI Lingling1
（1 Department of Dermatology，Dongzhimen Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing，100700，China; 2 Department of Dermatology，Peking University First Hospital，Beijing，100034，China; 3 Beijing Shijitan Hospital Affiliated to Capital Medical University，Beijing 100038，China; 4 Dongfang Hospital of Beijing University of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100078，China; 5 Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，People′s Hospital of Inner Mongolia Autonomous Region，Hohhot 010017，China）
Abstract Objective：To study the effects of different concentrations of Loureirin A on the proliferation，apoptosis and migration of keloid fibroblasts and the protein expression levels of Col-I、Col-III、α-SMA、Bax、Caspase-3. Methods：1） Different concentrations of L-Auxin A act on keloid fibroblasts. CellTiter-Blue vitality test was used to test the effects of L-Auxin A on keloid fibroblast proliferation. 2） Flow cytometry was used to detect the effects of L-Auxin A on keloid fibroblasts apoptosis. 3） Scratch test was used to detect the effects of borneol A on keloid fibroblast migration. 4） Proteins expression levels of Col-I、Col-III、α-SMA、Bax、Caspase-3 were detected by Western-Blot. Results：Loureirin A can inhibit the proliferation and migration of keloid fibroblasts，and induce their apoptosis，reduce the protein expression of Col-I、Col-III、α-SMA and promote the protein expression of Bax and caspase-3，and there is a dosage dependent relationship. Conclusion：Loureirin A can regulate the balance of keloid fibroblast proliferation and apoptosis，reduce the deposition of extracellular matrix，so it may play a certain therapeutic effects on keloid.
Keywords Loureirin A; Keloid; Fibroblast
中圖分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.06.003 瘢痕疙瘩（Keloid，KD）是皮肤损伤后结缔组织增生形成的软组织良性肿瘤[1]，病理本质为皮肤纤维化病变，以成纤维细胞（Fibroblast，Fb）过度增殖、胶原（Collagen，COL）及纤连蛋白等细胞外基质（Extracellular Matrix，ECM）过量累积为典型病理特征[2]。龙血素A（Loureirin A，化学名4′-羟基-2，6-二甲氧基二氢查尔酮）是树脂类药材龙血竭的主要活性成分，具有多种药理作用，有研究表明它可以抑制肝星状细胞的增殖、减少大鼠肺组织TGF-β1 mRNA的表达，从而在一定程度上具有延缓肝、肺纤维化的作用[3，4]。但龙血素A与瘢痕疙瘩的相关性研究尚未展开，因此本研究旨在观察龙血素A对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、凋亡以及细胞外基质主要蛋白的影响，初步探讨其与瘢痕疙瘩成纤维细胞生长的相关性。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞 实验所需瘢痕疙瘩成纤维细胞需通过原代培养获得，培养组织来源于北大第一医院皮肤科手术切除下的瘢痕组织，年龄18～40岁，所有患者均無其他器质性疾病。
1.1.2 药物 龙血素A干粉（Bioruler公司，美国，货号：119425）。取20 mg龙血素A干粉，溶于0.2 mL二甲亚砜（Solarbio公司，美国，货号：D8370）（DMSO），配成浓度为100 mg/mL的贮存液，-20 ℃保存，临时用时以10%胎牛血清（Gibco公司，美国，货号：10099141）稀释，使其终浓度为50、30、10 μg/mL。
1.1.3 试剂与仪器 DMEM培养基（货号：SH30022）、PBS磷酸盐缓冲液（货号：SH30256），均购于美国Hyclone公司;青/链霉素双抗（货号：15070063）、胎牛血清（货号：10099141）、0.05%胰酶（货号：25200056）、0.25%无EDTA胰酶（货号：15050065）均购于美国Gibco公司;CellTiter-Blue试剂（货号：G8080）购于美国Promega公司;Annexin V-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒（货号：556547）购于美国BD公司;ColI（货号：14695-1-AP）、ColIII（货号：22734-1-AP）、α-SMA（货号：55135-1-AP）、Bax（货号：50599-2-lg）、Caspase-3（货号：19677-1-AP）兔来源一抗，羊抗兔二抗（货号：SA00001-2），均购于美国Proteintech公司。CO2细胞培养箱（SANYO公司，日本，型号：MCO-20AIC）;全波长酶标仪（Thermo公司，美国，型号;Multiskan Sky）;倒置显微镜（Olympus公司，日本，型号：IMT-2）;流式细胞仪（Beckman Coulter公司，美国，型号：Cytomics FC 500）。
1.2 方法
1.2.1 细胞原代培养 修除瘢痕疙瘩组织的表皮和皮下组织并以生理盐水冲净后放入含500～1 000 U/mL青、链霉素的PBS液内带回无菌工作间。把组织块置于干净的培养皿内，用含100 U/mL青、链霉素的PBS液漂洗两遍后，再加入少许PBS，用小剪刀反复剪切组织块成1 mm3左右大小。将组织均匀接种于25 mL培养皿底部，加入4 mL含20%胎牛血清的DMEM培养基后，直立置于37 ℃，5% CO2饱和湿度下原代培养4 h，然后轻轻放平瓶体，次日加入2 mL培养基，之后每隔4.5 d换液1次。
1.2.2 CellTiter-Blue活力检测试验检测龙血素A对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的影响 收集对数生长期的瘢痕疙瘩成纤维细胞，取96孔板接种，调整细胞浓度为104个/μL接种于96孔板，每孔加入100 μL，（边缘孔用无菌PBS填充），37 ℃，5% CO2饱和湿度下孵育过夜。后按组分别加入100 μL浓度为100、60、20 μg/mL龙血素A作为实验组（使其终浓度为50、30、10 μg/mL），对照组为等体积10%胎牛血清（以DMEM配置），继续培养24、48、72 h。待达到预定时间后，避光条件下每孔加入20 μL CellTiter-Blue试剂，酶标仪（560Ex/590Em）测吸光度，记录结果并计算细胞抑制率。细胞抑制率=（对照孔-实验孔）/（对照孔-空白孔）×100%。每组设3个复孔，实验重复3次。
1.2.3 流式细胞术检测龙血素A对瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡的影响 以50、30、10 μg/mL龙血素A以及10%胎牛血清分别培养细胞，48 h后以0.25%无EDTA胰酶消化，制成单细胞悬液，离心弃上清液，预冷PBS洗涤1次，离心吸净上清，加入400 mL 1×结合缓冲液重悬细胞，继续加入5 μL Annexin V-FITC及5 μL碘化丙啶（Propidium，PI）染色液，混匀。室温避光孵育10～20 min，随后用流式细胞仪上机检测。
1.2.4 划痕实验检测龙血素A对瘢痕疙瘩成纤维细胞迁移的影响 取生长良好的瘢痕疙瘩成纤维细胞，细胞以2×105个/孔密度接种于6孔板中，孵育箱（37 ℃，5% CO2）孵育过夜，待形成细胞单层时，用5 mL的枪头在6孔板内垂直、均匀划直线，PBS清洗3遍除去脱落细胞，每孔分别加入2 mL浓度为50、30、10 μg/mL龙血素A作为实验组，对照组为等体积10%胎牛血清（以DMEM配置），继续培养24 h和48 h后，在光学显微镜下随机选择5个视野（×5），测量划痕宽度，比较各组划痕愈合的情况。实验重复3次。
1.2.5 Western-Blot测定龙血素A对瘢痕疙瘩成纤维细胞Col-I、Col-III、α-SMA、Bax、Caspase-3蛋白水平的影响 以50、30、10 mg/mL龙血素A以及10%胎牛血清分别培养细胞，48 h后提取蛋白总量，BCA试剂盒测定并计算样品蛋白浓度，SDS-PAGE凝胶电泳分离等量的蛋白质，然后转移到PVDE膜上，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，一抗孵育过夜，洗膜，用相匹配的二抗孵育1 h，以β-肌动蛋白作为内参，应用凝胶成像仪曝光显像，用软件检测条带灰度值，将待检测条带的灰度值除以相对应β-肌动蛋白的条带灰度值，所得数值即可代表待检测蛋白表达水平。 1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较若满足正态性及方差齐时，采用单因素方差分析;不满足时采用非参数检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 龙血素A对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的影响 不同浓度龙血素A作用于瘢痕成纤维细胞后，与对照组比较，抑制率随浓度升高而升高，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01），且各个浓度在48 h的抑制率均最高。考虑龙血素A对瘢痕疙瘩成纤维细胞的抑制作用具有浓度依赖性，且48 h为药物的最佳作用时间。见表2。
2.2 龙血素A对瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡的影响 与对照组比较，龙血素A作用于瘢痕疙瘩成纤维细胞48 h后，随着给药剂量的增加，活细胞数量明显降低，凋亡细胞数量明显增多，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。表明龙血素A能明显诱导瘢痕疙瘩成纤维细胞发生凋亡，且具有一定的浓度依賴性。见表2，图1。
2.3 划痕实验检测龙血素A对瘢痕疙瘩成纤维细胞迁移的影响 不同浓度龙血素A作用于瘢痕成纤维细胞48 h后，划痕宽度明显大于对照组，且给药浓度越大划痕越宽;与对照组比较，50 μg/mL、30 μg/mL、10 μg/mL浓度刺激时划痕收缩宽度的差异均有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。说明龙血素A以浓度依赖性抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的迁移。见表3，图2。
2.4 龙血素A对瘢痕疙瘩成纤维细胞COL-I、COL-III、α-SMA、Bax、Caspase-3蛋白表达的影响 与对照组比较，给药48 h后，龙血素A可下调瘢痕疙瘩成纤维细胞COL-I、COL-III、α-SMA蛋白表达，并上调Bax、Caspase-3蛋白表达，且随浓度的增加对三者的调控作用增强，50 μg/mL、30 μg/mL浓度刺激时，上述目标蛋白表达的差异有统计学意义（P<0.05）。说明龙血素A以浓度依赖性抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞COL-I、COL-III、α-SMA蛋白表达，同时促进Bax、Caspase-3蛋白表达。见表4，图3。
3 讨论
瘢痕疙瘩作为一种难治性皮肤病，常伴有瘙痒疼痛等症状，其损容性伤害给患者生命质量和心理健康也造成极大负面影响。发病机制方面，Fb是参与KD形成的关键效应细胞，它可以分泌ECM的主要成分Ⅰ、Ⅲ型胶原以及α-平滑肌肌动蛋白（α-Smooth Muscle Actin，α-SMA），从而形成KD的主要物质基础。当Fb过度增殖或凋亡抑制时，大量胶原蛋白沉积且胶原蛋白之间进行病理性交联，使ECM发生沉积和重构，从而形成KD[1]。因此，调控Fb增殖与凋亡的平衡对于抑制KD的形成至关重要。在线粒体通路的细胞凋亡中，Bax占优势时细胞则发生凋亡[7]，Caspase-3蛋白是细胞另一重要的促凋亡分子，也是细胞凋亡的重要标志[8]，既往如何抑制Fb增殖及胶原形成，通过上调Bax、Caspase-3等促凋亡因子表达以诱导其凋亡是研究的核心热点[9]。
目前其临床治疗主要包括手术疗法，放射、激光等物理疗法以及糖皮质激素等药物治疗[10]，但都具有一定的不良反应且易复发、难以根治，因此寻求新型、高效、低毒的抗KD新药物迫在眉睫。中医认为KD的关键病机为血行瘀滞，龙血竭外用具有散瘀止痛的功效，既往研究表明，其主要活性成分龙血素A在一定程度上可延缓肝、肺纤维化[3-4]，但与瘢痕疙瘩的相关性研究尚未展开，因此本研究旨在初步探讨龙血素A对瘢痕疙瘩成纤维细胞生长的相关作用。
在本研究中，CellTiter-Blue活力检测试验显示一定浓度龙血素A处理瘢痕疙瘩成纤维细胞后能够显著抑制细胞增殖，并且在呈剂量依赖关系，各个浓度均在48 h时抑制率最高;划痕实验表明，龙血素A以浓度依赖性抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的迁移;流式细胞仪检测结果显示龙血素A能明显诱导瘢痕疙瘩成纤维细胞发生凋亡，且具有一定的浓度依赖性。另本实验采用Western-Blot实验测定龙血素A对瘢痕疙瘩成纤维细胞COL-I、COL-III、α-SMA、Bax、Caspase-3蛋白水平的影响，结果显示龙血素A以浓度依赖性抑制COL-I、COL-III、α-SMA蛋白表达，同时促进Bax、Caspase-3蛋白表达，说明龙血素A可有效减少ECM的沉积，同时对Fb有促凋亡作用。
综上所述，龙血素A可抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、迁移并诱导其凋亡，同时减少COL-I、COL-III、α-SMA蛋白表达，并促进Bax、Caspase-3蛋白表达，说明龙血素A具有调控瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖与凋亡的平衡、减少细胞外基质沉积的作用，从而可能对KD发挥一定的治疗作用。目前KD的发病机制尚不完全明确，但TGF-β1/Smad通路持续激活所具有的促瘢痕效应已得到广泛公认[11]，因此龙血素A是否通过拮抗此通路的关键信号分子的表达从而发挥抗瘢痕效应需要下一步深入研究。
参考文献
[1]Williams FN，Herndon DN，Branski LK.Where we stand with human hypertrophic and keloid scar models[J].Exp Dermatol，2014，23（11）：811-812.
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[3]聂莉，程德云，朱刚艳，等.龙血竭对肺纤维化大鼠肺组织转化生长因子β1mRNA及Ⅰ型胶原蛋白表达的影响[J].河北中医，2010，32（7）：1071-1074，封3. [4]李玉莲，范红，宋正己，等.龙血素B对肝星状细胞增殖及细胞外基质分泌的影响[J].山东医药，2012，52（13）：7-9.
[5]Mari W，Alsabri SG，Tabal N，et al.Novel Insights on Understanding of Keloid Scar：Article Review[J].J Am Coll Clin Wound Spec，2015，7（1-3）：1-7.
[6]Lian N，Li T.Growth factor pathways in hypertrophic scars：Molecular pathogenesis and therapeutic implications[J].Biomed Pharmacother，2016，84（12）：42-50.
[7]Pettersson F，Dalgleish AG，Bissonnette RP，et al.Retinoids cause apoptosis in pancreatic cancer cells via activation of RAR-gamma and altered expression of Bcl-2/Bax[J].Br J Cancer，2002，87（5）：555-561.
[8]Liu BH，Chen L，Li SR，et al.Smac/DIABLO regulates the apoptosis of hypertrophic scar fibroblasts[J].Int J Mol Med，2013，32（3）：615-622.
[9]Pettersson F，Dalgleish AG，Bissonnette RP，et al.Retinoids cause apoptosis in pancreatic cancer cells via activation of RAR-gamma and altered expression of Bcl-2/Bax[J].Br J Cancer，2002，87（5）：555-561.
[10]Berman B，Maderal A，Raphael B.Keloids and Hypertrophic Scars：Pathophysiology，Classification，and Treatment[J].Dermatol Surg，2017，43（1）：S3-S18.
[11]Wu C，Jiang J，Boye A，et al.Compound Astragalus and Salvia miltiorrhiza extract suppresses rabbits′ hypertrophic scar by modulating the TGF-β/Smad signal[J].Dermatology，2014，229（4）：363-368.
（2019-10-16收稿 責任编辑：王明）
基金项目：中央高校基本科研业务费专项资金资助项目（2019-JYB-JS-050）作者简介：马卉（1989.04—），女，博士研究生在读，研究方向：中医皮肤病方向，E-mail：[email protected]通信作者：段行武（1965.07—），男，博士，主任医师，研究方向：中医皮肤病方向，E-mail：[email protected];李玲玲（1980.10—），女，博士，副主任医师，研究方向：中医皮肤病方向，E-mail：[email protected]
关键词 龙血素A;瘢痕疙瘩;成纤维细胞
Study on the Effects of Loureirin A on Keloid Fibroblast Growth Function
MA Hui1，ZHANG Runtian1，LI Hang2，HUANG Min1，CHEN Guangshan1，LIU Yang3，QU Tiange4，BAO Hailan5，ZHOU Lin1，ZHAO Yan1，DUAN Xingwu1，LI Lingling1
（1 Department of Dermatology，Dongzhimen Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing，100700，China; 2 Department of Dermatology，Peking University First Hospital，Beijing，100034，China; 3 Beijing Shijitan Hospital Affiliated to Capital Medical University，Beijing 100038，China; 4 Dongfang Hospital of Beijing University of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100078，China; 5 Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，People′s Hospital of Inner Mongolia Autonomous Region，Hohhot 010017，China）
Abstract Objective：To study the effects of different concentrations of Loureirin A on the proliferation，apoptosis and migration of keloid fibroblasts and the protein expression levels of Col-I、Col-III、α-SMA、Bax、Caspase-3. Methods：1） Different concentrations of L-Auxin A act on keloid fibroblasts. CellTiter-Blue vitality test was used to test the effects of L-Auxin A on keloid fibroblast proliferation. 2） Flow cytometry was used to detect the effects of L-Auxin A on keloid fibroblasts apoptosis. 3） Scratch test was used to detect the effects of borneol A on keloid fibroblast migration. 4） Proteins expression levels of Col-I、Col-III、α-SMA、Bax、Caspase-3 were detected by Western-Blot. Results：Loureirin A can inhibit the proliferation and migration of keloid fibroblasts，and induce their apoptosis，reduce the protein expression of Col-I、Col-III、α-SMA and promote the protein expression of Bax and caspase-3，and there is a dosage dependent relationship. Conclusion：Loureirin A can regulate the balance of keloid fibroblast proliferation and apoptosis，reduce the deposition of extracellular matrix，so it may play a certain therapeutic effects on keloid.
Keywords Loureirin A; Keloid; Fibroblast
中圖分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.06.003 瘢痕疙瘩（Keloid，KD）是皮肤损伤后结缔组织增生形成的软组织良性肿瘤[1]，病理本质为皮肤纤维化病变，以成纤维细胞（Fibroblast，Fb）过度增殖、胶原（Collagen，COL）及纤连蛋白等细胞外基质（Extracellular Matrix，ECM）过量累积为典型病理特征[2]。龙血素A（Loureirin A，化学名4′-羟基-2，6-二甲氧基二氢查尔酮）是树脂类药材龙血竭的主要活性成分，具有多种药理作用，有研究表明它可以抑制肝星状细胞的增殖、减少大鼠肺组织TGF-β1 mRNA的表达，从而在一定程度上具有延缓肝、肺纤维化的作用[3，4]。但龙血素A与瘢痕疙瘩的相关性研究尚未展开，因此本研究旨在观察龙血素A对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、凋亡以及细胞外基质主要蛋白的影响，初步探讨其与瘢痕疙瘩成纤维细胞生长的相关性。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞 实验所需瘢痕疙瘩成纤维细胞需通过原代培养获得，培养组织来源于北大第一医院皮肤科手术切除下的瘢痕组织，年龄18～40岁，所有患者均無其他器质性疾病。
1.1.2 药物 龙血素A干粉（Bioruler公司，美国，货号：119425）。取20 mg龙血素A干粉，溶于0.2 mL二甲亚砜（Solarbio公司，美国，货号：D8370）（DMSO），配成浓度为100 mg/mL的贮存液，-20 ℃保存，临时用时以10%胎牛血清（Gibco公司，美国，货号：10099141）稀释，使其终浓度为50、30、10 μg/mL。
1.1.3 试剂与仪器 DMEM培养基（货号：SH30022）、PBS磷酸盐缓冲液（货号：SH30256），均购于美国Hyclone公司;青/链霉素双抗（货号：15070063）、胎牛血清（货号：10099141）、0.05%胰酶（货号：25200056）、0.25%无EDTA胰酶（货号：15050065）均购于美国Gibco公司;CellTiter-Blue试剂（货号：G8080）购于美国Promega公司;Annexin V-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒（货号：556547）购于美国BD公司;ColI（货号：14695-1-AP）、ColIII（货号：22734-1-AP）、α-SMA（货号：55135-1-AP）、Bax（货号：50599-2-lg）、Caspase-3（货号：19677-1-AP）兔来源一抗，羊抗兔二抗（货号：SA00001-2），均购于美国Proteintech公司。CO2细胞培养箱（SANYO公司，日本，型号：MCO-20AIC）;全波长酶标仪（Thermo公司，美国，型号;Multiskan Sky）;倒置显微镜（Olympus公司，日本，型号：IMT-2）;流式细胞仪（Beckman Coulter公司，美国，型号：Cytomics FC 500）。
1.2 方法
1.2.1 细胞原代培养 修除瘢痕疙瘩组织的表皮和皮下组织并以生理盐水冲净后放入含500～1 000 U/mL青、链霉素的PBS液内带回无菌工作间。把组织块置于干净的培养皿内，用含100 U/mL青、链霉素的PBS液漂洗两遍后，再加入少许PBS，用小剪刀反复剪切组织块成1 mm3左右大小。将组织均匀接种于25 mL培养皿底部，加入4 mL含20%胎牛血清的DMEM培养基后，直立置于37 ℃，5% CO2饱和湿度下原代培养4 h，然后轻轻放平瓶体，次日加入2 mL培养基，之后每隔4.5 d换液1次。
1.2.2 CellTiter-Blue活力检测试验检测龙血素A对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的影响 收集对数生长期的瘢痕疙瘩成纤维细胞，取96孔板接种，调整细胞浓度为104个/μL接种于96孔板，每孔加入100 μL，（边缘孔用无菌PBS填充），37 ℃，5% CO2饱和湿度下孵育过夜。后按组分别加入100 μL浓度为100、60、20 μg/mL龙血素A作为实验组（使其终浓度为50、30、10 μg/mL），对照组为等体积10%胎牛血清（以DMEM配置），继续培养24、48、72 h。待达到预定时间后，避光条件下每孔加入20 μL CellTiter-Blue试剂，酶标仪（560Ex/590Em）测吸光度，记录结果并计算细胞抑制率。细胞抑制率=（对照孔-实验孔）/（对照孔-空白孔）×100%。每组设3个复孔，实验重复3次。
1.2.3 流式细胞术检测龙血素A对瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡的影响 以50、30、10 μg/mL龙血素A以及10%胎牛血清分别培养细胞，48 h后以0.25%无EDTA胰酶消化，制成单细胞悬液，离心弃上清液，预冷PBS洗涤1次，离心吸净上清，加入400 mL 1×结合缓冲液重悬细胞，继续加入5 μL Annexin V-FITC及5 μL碘化丙啶（Propidium，PI）染色液，混匀。室温避光孵育10～20 min，随后用流式细胞仪上机检测。
1.2.4 划痕实验检测龙血素A对瘢痕疙瘩成纤维细胞迁移的影响 取生长良好的瘢痕疙瘩成纤维细胞，细胞以2×105个/孔密度接种于6孔板中，孵育箱（37 ℃，5% CO2）孵育过夜，待形成细胞单层时，用5 mL的枪头在6孔板内垂直、均匀划直线，PBS清洗3遍除去脱落细胞，每孔分别加入2 mL浓度为50、30、10 μg/mL龙血素A作为实验组，对照组为等体积10%胎牛血清（以DMEM配置），继续培养24 h和48 h后，在光学显微镜下随机选择5个视野（×5），测量划痕宽度，比较各组划痕愈合的情况。实验重复3次。
1.2.5 Western-Blot测定龙血素A对瘢痕疙瘩成纤维细胞Col-I、Col-III、α-SMA、Bax、Caspase-3蛋白水平的影响 以50、30、10 mg/mL龙血素A以及10%胎牛血清分别培养细胞，48 h后提取蛋白总量，BCA试剂盒测定并计算样品蛋白浓度，SDS-PAGE凝胶电泳分离等量的蛋白质，然后转移到PVDE膜上，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，一抗孵育过夜，洗膜，用相匹配的二抗孵育1 h，以β-肌动蛋白作为内参，应用凝胶成像仪曝光显像，用软件检测条带灰度值，将待检测条带的灰度值除以相对应β-肌动蛋白的条带灰度值，所得数值即可代表待检测蛋白表达水平。 1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较若满足正态性及方差齐时，采用单因素方差分析;不满足时采用非参数检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 龙血素A对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的影响 不同浓度龙血素A作用于瘢痕成纤维细胞后，与对照组比较，抑制率随浓度升高而升高，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01），且各个浓度在48 h的抑制率均最高。考虑龙血素A对瘢痕疙瘩成纤维细胞的抑制作用具有浓度依赖性，且48 h为药物的最佳作用时间。见表2。
2.2 龙血素A对瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡的影响 与对照组比较，龙血素A作用于瘢痕疙瘩成纤维细胞48 h后，随着给药剂量的增加，活细胞数量明显降低，凋亡细胞数量明显增多，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。表明龙血素A能明显诱导瘢痕疙瘩成纤维细胞发生凋亡，且具有一定的浓度依賴性。见表2，图1。
2.3 划痕实验检测龙血素A对瘢痕疙瘩成纤维细胞迁移的影响 不同浓度龙血素A作用于瘢痕成纤维细胞48 h后，划痕宽度明显大于对照组，且给药浓度越大划痕越宽;与对照组比较，50 μg/mL、30 μg/mL、10 μg/mL浓度刺激时划痕收缩宽度的差异均有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。说明龙血素A以浓度依赖性抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的迁移。见表3，图2。
2.4 龙血素A对瘢痕疙瘩成纤维细胞COL-I、COL-III、α-SMA、Bax、Caspase-3蛋白表达的影响 与对照组比较，给药48 h后，龙血素A可下调瘢痕疙瘩成纤维细胞COL-I、COL-III、α-SMA蛋白表达，并上调Bax、Caspase-3蛋白表达，且随浓度的增加对三者的调控作用增强，50 μg/mL、30 μg/mL浓度刺激时，上述目标蛋白表达的差异有统计学意义（P<0.05）。说明龙血素A以浓度依赖性抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞COL-I、COL-III、α-SMA蛋白表达，同时促进Bax、Caspase-3蛋白表达。见表4，图3。
3 讨论
瘢痕疙瘩作为一种难治性皮肤病，常伴有瘙痒疼痛等症状，其损容性伤害给患者生命质量和心理健康也造成极大负面影响。发病机制方面，Fb是参与KD形成的关键效应细胞，它可以分泌ECM的主要成分Ⅰ、Ⅲ型胶原以及α-平滑肌肌动蛋白（α-Smooth Muscle Actin，α-SMA），从而形成KD的主要物质基础。当Fb过度增殖或凋亡抑制时，大量胶原蛋白沉积且胶原蛋白之间进行病理性交联，使ECM发生沉积和重构，从而形成KD[1]。因此，调控Fb增殖与凋亡的平衡对于抑制KD的形成至关重要。在线粒体通路的细胞凋亡中，Bax占优势时细胞则发生凋亡[7]，Caspase-3蛋白是细胞另一重要的促凋亡分子，也是细胞凋亡的重要标志[8]，既往如何抑制Fb增殖及胶原形成，通过上调Bax、Caspase-3等促凋亡因子表达以诱导其凋亡是研究的核心热点[9]。
目前其临床治疗主要包括手术疗法，放射、激光等物理疗法以及糖皮质激素等药物治疗[10]，但都具有一定的不良反应且易复发、难以根治，因此寻求新型、高效、低毒的抗KD新药物迫在眉睫。中医认为KD的关键病机为血行瘀滞，龙血竭外用具有散瘀止痛的功效，既往研究表明，其主要活性成分龙血素A在一定程度上可延缓肝、肺纤维化[3-4]，但与瘢痕疙瘩的相关性研究尚未展开，因此本研究旨在初步探讨龙血素A对瘢痕疙瘩成纤维细胞生长的相关作用。
在本研究中，CellTiter-Blue活力检测试验显示一定浓度龙血素A处理瘢痕疙瘩成纤维细胞后能够显著抑制细胞增殖，并且在呈剂量依赖关系，各个浓度均在48 h时抑制率最高;划痕实验表明，龙血素A以浓度依赖性抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的迁移;流式细胞仪检测结果显示龙血素A能明显诱导瘢痕疙瘩成纤维细胞发生凋亡，且具有一定的浓度依赖性。另本实验采用Western-Blot实验测定龙血素A对瘢痕疙瘩成纤维细胞COL-I、COL-III、α-SMA、Bax、Caspase-3蛋白水平的影响，结果显示龙血素A以浓度依赖性抑制COL-I、COL-III、α-SMA蛋白表达，同时促进Bax、Caspase-3蛋白表达，说明龙血素A可有效减少ECM的沉积，同时对Fb有促凋亡作用。
综上所述，龙血素A可抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、迁移并诱导其凋亡，同时减少COL-I、COL-III、α-SMA蛋白表达，并促进Bax、Caspase-3蛋白表达，说明龙血素A具有调控瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖与凋亡的平衡、减少细胞外基质沉积的作用，从而可能对KD发挥一定的治疗作用。目前KD的发病机制尚不完全明确，但TGF-β1/Smad通路持续激活所具有的促瘢痕效应已得到广泛公认[11]，因此龙血素A是否通过拮抗此通路的关键信号分子的表达从而发挥抗瘢痕效应需要下一步深入研究。
参考文献
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（2019-10-16收稿 責任编辑：王明）
基金项目：中央高校基本科研业务费专项资金资助项目（2019-JYB-JS-050）作者简介：马卉（1989.04—），女，博士研究生在读，研究方向：中医皮肤病方向，E-mail：[email protected]通信作者：段行武（1965.07—），男，博士，主任医师，研究方向：中医皮肤病方向，E-mail：[email protected];李玲玲（1980.10—），女，博士，副主任医师，研究方向：中医皮肤病方向，E-mail：[email protected]