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摘要[目的]优化马尾千金草生物碱的提取条件。[方法]以马尾千金草的总生物碱含量为指标，运用正交试验设计对酸水浓度、料液比、浸提次数3个因素进行考查，优化最佳提取工艺。[结果]酸水浸泡提取的最佳条件为加入10倍的1%酸水液，浸泡提取3次，每次24 h，生物碱得率为0.0751%，马尾千金草生物碱含量为7.51 mg/g。[结论]该提取方法操作较简单、成本低、生物碱得率高，能有效提取马尾千金草总生物碱。
关键词马尾千金草；总生物碱；正交试验；优化提取
中图分类号S567.23文献标识码A文章编号0517-6611（2017）14-0115-02
Abstract[Objective] The research aimed to optimize the extraction condition of alkaloids from Lyeopodium sieboldii.[Method]Taking the total alkaloid content of Lyeopodium sieboldii as index，the orthogonal experiment was used to evaluate acid water concentration，solidliquid ratio and extraction times.The optimum extraction process was optimized.[Result]The optimum condition of the acid water extraction was 1% acid water solution with 10 times，soaking and extracting for 3 times，each time 24 h，the total alkaloids was 0.0751%，the alkaloid content of Lyeopodium sieboldii was 7.51 mg/g.[Conclusion]The extraction method is simple，low operation cost，high rate of alkaloids，which can effectively extract the total alkaloids of Lyeopodium sieboldii.
Key wordsLyeopodium sieboldii Miq；Total alkaloids；Orthogonal experiment；Optimal extraction
马尾千金草（Lyeopodium sieboldii Miq），别名马尾伸筋草、马尾青青草、飞龙，为石松科植物马尾杉属植物鳞叶马尾杉的全草，多年生常绿草本，外形状如马尾，价格昂贵，故有马尾千金草之称。味平，性淡；舒筋活络、祛风湿，主治跌打损伤、肌肉痉挛、筋骨疼痛[1]，分布于台湾、广西，日本也有分布[2]。广西崇左大新县、天等县及相邻的白色靖西县、德保县均有分布，当地壮民常用其治疗跌打扭伤、风湿关节痛、肥大性脊椎炎、类风湿性关节炎。20世纪80年代中期，有学者从民间草药千层塔中分离得到了具有很强地抑制乙酰胆碱酯酶活性[3-4]和提高学习记忆功能[5]的石杉碱甲。陈业高等[6]从同类石杉科蛇足石杉中分离得到具有强效、低毒、高选择性抑制乙酰胆碱酯酶活性的生物碱石杉碱甲，临床试验研究表明其对治疗重症肌无力和抗老年性痴呆有显著疗效，被国际上列为第二代乙酰胆碱酯酶抑制剂之一。现代药理试验表明，石松生物碱在对心血管系统、神经肌肉以及精神分裂症、发热和青光眼等治疗方面具有一定的作用[7-8]，因此研究石松科植物生物碱具有一定的临床意义。
石松生物碱可采用多种方法进行提取，如酸水提取、醇提法、超声波提取法等[9]。但酸水提取法以外的方法，大多操作方法比较烦琐，如醇提法提取需加热，生物碱结构可能会因为温度问题而遭到破坏，致使提取产物不纯，且试验需要用到大量的乙醇，成本高，产率不高，不适合大规模制备。因此該试验采用酸水浸提法与阳离子交换树脂法相结合的方法提取总生物碱。在该试验的前期工作中以氧化铝薄层层析法检测该植物含有生物碱，并采用单因素试验考察了酸水浓度、料液比、浸提次数对总生物碱得率的影响，在此以苦参碱为标准品，采用酸性染料比色法测生物碱得率，并采用正交试验，优化马尾千金草酸水法提取生物碱的工艺，为后续进一步研究奠定理论基础。
1材料与方法
1.1仪器UV-3010型紫外可见分光光度计，CT -C-2型电热恒温干燥箱，SHZ-D-3 型循环水式真空泵，XLF-30B型超微粉碎机，层析柱，001×7型阳离子交换树脂。
1.2试材马尾千金草，采购于广西崇左市大新县，超微粉碎，过200目筛备用。
1.3方法
1.3.1标准品溶液的制备。准确称取25.00 mg苦参碱标准品，置于50 mL容量瓶中，用甲醇稀释、摇匀，配制成0.5 mg/mL标准液。分别移取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL母液于50 mL的容量瓶中，加甲醇稀释，配制成梯度浓度的标准液。
1.3.2样品溶液的制备。将马尾千金草超微粉碎后，分别用浓度为0.1%、0.5%、1.0%的盐酸溶液浸泡[10]，以不同的料液比，每次浸泡24 h。过滤，经阳离子交换树脂，用150 mL8%氨水乙醇洗脱树脂[11]，将洗脱液萃取后低温蒸干，用甲醇溶解，定容至250 mL，得样品溶液。
1.3.3波长检测。分别移取少量不同浓度的标准品溶液和样品溶液，利用紫外分光光度计，在波长300～500 nm处进行扫描，得到紫外吸收数据，确定标准溶液在波长423 nm处的吸光度最大，样品液在423 nm处吸收值最大。则选取测定波长为423 nm。 1.3.4标准曲线的绘制。分别移取梯度浓度的标准液 1 mL置于分液漏斗中，添加溴麝香草酚蓝溶液1 mL、pH为6.5的缓冲液，再移入三氯甲烷溶液10 mL，振荡摇匀，静置后，取下层，在波长423 nm处测定不同浓度标准溶液的吸光度，以三氯甲烷溶液为空白液。以标准液质量浓度（C）为横坐标、吸光度（A）为纵坐标绘制标准曲线。
1.3.5样品溶液中生物碱含量的测定。按照“1.3.4”方法测定不同浓度样品溶液的吸光度。根据苦参碱线性回归方程计算得样品液中生物总碱的含量。
1.3.6生物碱得率的计算。将测得的样品溶液吸光度（A）代入标准品的线性回归方程，得样品溶液浓度C（mg/mL）。提取物中生物碱质量（m）=C×V，生物碱得率=m/M×100%，其中M为粗草的质量。
1.3.7正交试验设计。分别选取酸水浓度、料液比、浸泡次数3个因素进行正交试验设计。精确称取马尾千金草粉末10.00 g（9份），按照正交试验因素表（表1）进行试验，得生物总碱，再通过酸性染料比色法测定样品中总生物碱含量[12]，最后计算得率。
2结果与分析
2.1苦参碱标准曲线绘制按照“1.3.4”操作，以标准溶液质量浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线（图1），得出苦参碱的线性回归方程为y=175.25x+0.166 3（R2=0.999 2），表明苦参碱含量在0.001～0.006 mg/mL线性关系良好。
图1苦参碱标准曲线
Fig.1Standard curve of matrine2.2正交试验由表2可知，各因素对酸水提取法的影响从大到小依次为A、B、C，即酸水浓度的影响最大，其次是料液比，浸提次数的影响最小；酸水提取法的最佳提取工艺是A3B1C1，即盐酸溶液浓度为1.0%、料液比1∶10，浸提次数1次。综合考虑预试验中单因素试验和正交试验结果，最终确定酸水提取法的最佳提取条件为A3B1C3，即盐酸溶液浓度为1.0%，料液比1∶10，浸提3次，每次24 h，生物碱得率为0.075 1%，马尾千金草中生物碱含量为7.51 mg/g。
3讨论与小结
马尾千金草为石松科植物，预试验以氧化铝薄层层析法[13]检测生物碱，结果出现橘红色斑点，证明马尾千金草提取液中存在生物碱。单因素试验结果生物碱得率几乎随着酸水浓度的增大而增大，但当浓度超过1%时，生物碱得率基本没有太大的变化；在料液比增大的同时，得率逐渐增大，但在料液比超过1∶15后，得率无显著变化；生物碱得率随浸提次数的增加而增大，当浸提次数超过3次，得率基本不变。综合考虑单因素预试验结果与正交试验结果，确定提取壮药马尾千金草生物碱的最佳提取条件为料液比1∶10，浸提3次，每次24 h。该方法操作简便、成本低、可行，可作为壮药马尾千金草生物碱提取方法的参考，为进一步做其药理研究奠定基础。
参考文献
[1] 广西壮族自治区卫生厅.广西中药志：第1集[M].南宁：广西壮族自治区人民出版社，1959：330.
[2] 余传隆，黄泰康，丁志遵，等.中药辞海：第一卷[M].北京：中国医药科技出版社，1993：646-647.
[3] 刘嘉森，俞超美，周有作，等.石杉碱甲和石杉碱乙的化学研究[J].化学学报，1986，44（10）：1035-1040.
[4] 王月娥，岳冬贤，唐希灿.石杉碱甲的抗胆碱酯酶作用[J].中国药理学报，1986，7（2）：110-113.
[5] 唐希灿，韩怡凡，陈小萍，等.石杉碱甲对大鼠辨别学习和再现过程的影响[J].中国药理学报，1986，7（6）：507-511.
[6] 陈业高，刘怡君，蒋金和，等.石松类生物碱成分研究的新进展[J].云南师范大学学报，2010，30（6）：12-23.
[7] 叶茂宗，叶升儒.石松生物学特性及生境特点的观察[J].生态学杂志，1993，12（3）：19-22.
[8] 杨阳，张建胜，董秀华，等.HPLC法测定巍山扁枝石松中石杉碱甲的含量[J].云南民族大学学报（自然科学版），2009，18（2）：146-147.
[9] 周文华，杨辉荣，岳庆磊.生物碱提取和分离方法的研究新进展[J].当代化工，2003，32（2）：111-113.
[10] 李義平，杨广德，贺浪冲.红毛七总生物碱提取工艺研究[J].中药材，2007，30（2）：220-223.
[11] 何凡，刘威，徐秋阳，等.伸筋草总生物碱提取工艺[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（7）：25-28.
[12] 邵晶，倪京满，郭玫，等.苦参药材中总生物碱含量的测定[J].安徽农业科学，2008，36（36）：15950-15951，15967.
[13] 黄景怡，钟振声.蒲公英生物碱提取工艺的研究[J].广东科技，2009（12）：75-76.
关键词马尾千金草；总生物碱；正交试验；优化提取
中图分类号S567.23文献标识码A文章编号0517-6611（2017）14-0115-02
Abstract[Objective] The research aimed to optimize the extraction condition of alkaloids from Lyeopodium sieboldii.[Method]Taking the total alkaloid content of Lyeopodium sieboldii as index，the orthogonal experiment was used to evaluate acid water concentration，solidliquid ratio and extraction times.The optimum extraction process was optimized.[Result]The optimum condition of the acid water extraction was 1% acid water solution with 10 times，soaking and extracting for 3 times，each time 24 h，the total alkaloids was 0.0751%，the alkaloid content of Lyeopodium sieboldii was 7.51 mg/g.[Conclusion]The extraction method is simple，low operation cost，high rate of alkaloids，which can effectively extract the total alkaloids of Lyeopodium sieboldii.
Key wordsLyeopodium sieboldii Miq；Total alkaloids；Orthogonal experiment；Optimal extraction
马尾千金草（Lyeopodium sieboldii Miq），别名马尾伸筋草、马尾青青草、飞龙，为石松科植物马尾杉属植物鳞叶马尾杉的全草，多年生常绿草本，外形状如马尾，价格昂贵，故有马尾千金草之称。味平，性淡；舒筋活络、祛风湿，主治跌打损伤、肌肉痉挛、筋骨疼痛[1]，分布于台湾、广西，日本也有分布[2]。广西崇左大新县、天等县及相邻的白色靖西县、德保县均有分布，当地壮民常用其治疗跌打扭伤、风湿关节痛、肥大性脊椎炎、类风湿性关节炎。20世纪80年代中期，有学者从民间草药千层塔中分离得到了具有很强地抑制乙酰胆碱酯酶活性[3-4]和提高学习记忆功能[5]的石杉碱甲。陈业高等[6]从同类石杉科蛇足石杉中分离得到具有强效、低毒、高选择性抑制乙酰胆碱酯酶活性的生物碱石杉碱甲，临床试验研究表明其对治疗重症肌无力和抗老年性痴呆有显著疗效，被国际上列为第二代乙酰胆碱酯酶抑制剂之一。现代药理试验表明，石松生物碱在对心血管系统、神经肌肉以及精神分裂症、发热和青光眼等治疗方面具有一定的作用[7-8]，因此研究石松科植物生物碱具有一定的临床意义。
石松生物碱可采用多种方法进行提取，如酸水提取、醇提法、超声波提取法等[9]。但酸水提取法以外的方法，大多操作方法比较烦琐，如醇提法提取需加热，生物碱结构可能会因为温度问题而遭到破坏，致使提取产物不纯，且试验需要用到大量的乙醇，成本高，产率不高，不适合大规模制备。因此該试验采用酸水浸提法与阳离子交换树脂法相结合的方法提取总生物碱。在该试验的前期工作中以氧化铝薄层层析法检测该植物含有生物碱，并采用单因素试验考察了酸水浓度、料液比、浸提次数对总生物碱得率的影响，在此以苦参碱为标准品，采用酸性染料比色法测生物碱得率，并采用正交试验，优化马尾千金草酸水法提取生物碱的工艺，为后续进一步研究奠定理论基础。
1材料与方法
1.1仪器UV-3010型紫外可见分光光度计，CT -C-2型电热恒温干燥箱，SHZ-D-3 型循环水式真空泵，XLF-30B型超微粉碎机，层析柱，001×7型阳离子交换树脂。
1.2试材马尾千金草，采购于广西崇左市大新县，超微粉碎，过200目筛备用。
1.3方法
1.3.1标准品溶液的制备。准确称取25.00 mg苦参碱标准品，置于50 mL容量瓶中，用甲醇稀释、摇匀，配制成0.5 mg/mL标准液。分别移取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL母液于50 mL的容量瓶中，加甲醇稀释，配制成梯度浓度的标准液。
1.3.2样品溶液的制备。将马尾千金草超微粉碎后，分别用浓度为0.1%、0.5%、1.0%的盐酸溶液浸泡[10]，以不同的料液比，每次浸泡24 h。过滤，经阳离子交换树脂，用150 mL8%氨水乙醇洗脱树脂[11]，将洗脱液萃取后低温蒸干，用甲醇溶解，定容至250 mL，得样品溶液。
1.3.3波长检测。分别移取少量不同浓度的标准品溶液和样品溶液，利用紫外分光光度计，在波长300～500 nm处进行扫描，得到紫外吸收数据，确定标准溶液在波长423 nm处的吸光度最大，样品液在423 nm处吸收值最大。则选取测定波长为423 nm。 1.3.4标准曲线的绘制。分别移取梯度浓度的标准液 1 mL置于分液漏斗中，添加溴麝香草酚蓝溶液1 mL、pH为6.5的缓冲液，再移入三氯甲烷溶液10 mL，振荡摇匀，静置后，取下层，在波长423 nm处测定不同浓度标准溶液的吸光度，以三氯甲烷溶液为空白液。以标准液质量浓度（C）为横坐标、吸光度（A）为纵坐标绘制标准曲线。
1.3.5样品溶液中生物碱含量的测定。按照“1.3.4”方法测定不同浓度样品溶液的吸光度。根据苦参碱线性回归方程计算得样品液中生物总碱的含量。
1.3.6生物碱得率的计算。将测得的样品溶液吸光度（A）代入标准品的线性回归方程，得样品溶液浓度C（mg/mL）。提取物中生物碱质量（m）=C×V，生物碱得率=m/M×100%，其中M为粗草的质量。
1.3.7正交试验设计。分别选取酸水浓度、料液比、浸泡次数3个因素进行正交试验设计。精确称取马尾千金草粉末10.00 g（9份），按照正交试验因素表（表1）进行试验，得生物总碱，再通过酸性染料比色法测定样品中总生物碱含量[12]，最后计算得率。
2结果与分析
2.1苦参碱标准曲线绘制按照“1.3.4”操作，以标准溶液质量浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线（图1），得出苦参碱的线性回归方程为y=175.25x+0.166 3（R2=0.999 2），表明苦参碱含量在0.001～0.006 mg/mL线性关系良好。
图1苦参碱标准曲线
Fig.1Standard curve of matrine2.2正交试验由表2可知，各因素对酸水提取法的影响从大到小依次为A、B、C，即酸水浓度的影响最大，其次是料液比，浸提次数的影响最小；酸水提取法的最佳提取工艺是A3B1C1，即盐酸溶液浓度为1.0%、料液比1∶10，浸提次数1次。综合考虑预试验中单因素试验和正交试验结果，最终确定酸水提取法的最佳提取条件为A3B1C3，即盐酸溶液浓度为1.0%，料液比1∶10，浸提3次，每次24 h，生物碱得率为0.075 1%，马尾千金草中生物碱含量为7.51 mg/g。
3讨论与小结
马尾千金草为石松科植物，预试验以氧化铝薄层层析法[13]检测生物碱，结果出现橘红色斑点，证明马尾千金草提取液中存在生物碱。单因素试验结果生物碱得率几乎随着酸水浓度的增大而增大，但当浓度超过1%时，生物碱得率基本没有太大的变化；在料液比增大的同时，得率逐渐增大，但在料液比超过1∶15后，得率无显著变化；生物碱得率随浸提次数的增加而增大，当浸提次数超过3次，得率基本不变。综合考虑单因素预试验结果与正交试验结果，确定提取壮药马尾千金草生物碱的最佳提取条件为料液比1∶10，浸提3次，每次24 h。该方法操作简便、成本低、可行，可作为壮药马尾千金草生物碱提取方法的参考，为进一步做其药理研究奠定基础。
参考文献
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[4] 王月娥，岳冬贤，唐希灿.石杉碱甲的抗胆碱酯酶作用[J].中国药理学报，1986，7（2）：110-113.
[5] 唐希灿，韩怡凡，陈小萍，等.石杉碱甲对大鼠辨别学习和再现过程的影响[J].中国药理学报，1986，7（6）：507-511.
[6] 陈业高，刘怡君，蒋金和，等.石松类生物碱成分研究的新进展[J].云南师范大学学报，2010，30（6）：12-23.
[7] 叶茂宗，叶升儒.石松生物学特性及生境特点的观察[J].生态学杂志，1993，12（3）：19-22.
[8] 杨阳，张建胜，董秀华，等.HPLC法测定巍山扁枝石松中石杉碱甲的含量[J].云南民族大学学报（自然科学版），2009，18（2）：146-147.
[9] 周文华，杨辉荣，岳庆磊.生物碱提取和分离方法的研究新进展[J].当代化工，2003，32（2）：111-113.
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[12] 邵晶，倪京满，郭玫，等.苦参药材中总生物碱含量的测定[J].安徽农业科学，2008，36（36）：15950-15951，15967.
[13] 黄景怡，钟振声.蒲公英生物碱提取工艺的研究[J].广东科技，2009（12）：75-76.