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摘要：为降低烟草连作对烟叶产量和品质以及烟草生长发育带来的不良影响，通过平板筛选和摇床复筛，从烤烟根系分泌物中筛选出一株能高效降解苯甲酸的菌株。结果表明，根据rDNA-ITS的扩增及序列分析、培养特征及形态特征观察初步鉴定该菌株为黄曲霉（Aspergillus flavus）；该菌株培养15d内，在0-800μmol/L苯甲酸浓度范围内能够正常生长，800-1600μmol/L苯甲酸浓度范围内生长受到一定程度抑制；该降解菌在以苯甲酸为唯一碳源的800μmol/L浓度LBA培养基中菌株干重、降解率均达到最大，菌株干重为0.765g，降解率为19.98%：菌株在培养至第9天时降解速率达到最快，为8.5mg/d；烤烟幼苗生长过程中施加降解菌液能在一定程度上降低根系分泌物的抑制作用。该降解菌株在盆栽试验中能够降低根系分泌物对烤烟的自毒作用，使微生物菌株降解烤烟自毒物质来克服连作障碍成为可能。
关键词：烤烟；苯甲酸降解菌；分离鉴定；连作障碍
中图分类号：S345.72
文章编号：1007-5119（2016）01-0072-06
DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2016.01.013
鉴于我国农田种植制度、土地流转方式及经济效益方面的考虑，烟草连作障碍依然普遍，已成为制约我国烟草农业发展的障碍之一。烤烟根系在生长过程中会分泌一些有害物质，在土壤中积累到一定程度时会抑制烤烟本身及其他作物的生长，同时导致土壤理化性状恶化、土传病害日趋严重。烤烟根系分泌物释放的烟碱、水杨酸、苯甲酸、2-羟基丙酸等均可降低植烟土壤利用率和烟叶品质。有研究报道，采用作物轮作、施用土壤改良剂和微生物肥料等方法，可以缓解由于营养元素失衡和土传病害增多引起的连作现象，但关于烤烟自毒物质的生物可降解性报道还不多见，只有毛宁等、苗艳芳等和周治等对植物根系分泌物降解菌有少许研究。上述研究主要针对细菌和放线菌，关于真菌的研究较少，尤其真菌对苯甲酸降解效果研究未见报道。本研究针对烤烟连作自毒作用的生物降解菌进行分离筛选，对分离的菌株进行分子生物学鉴定，并进行盆栽试验验证其降解效果，进一步探讨利用微生物菌株降解烤烟自毒物质的可行性，为烤烟连作障碍修复提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 供试培养基
真菌培养选用马丁氏培养基，活化培养及保存方法参照文献以苯甲酸为唯一碳源真菌培养基：磷酸二氢钾Ig，七水硫酸镁0.5g，1/300孟加拉红水溶液3mL，pH自然，定容至IL，固体培养基用于降解苯甲酸真菌的筛选；液体培养基分装后，加入苯甲酸，使苯甲酸的终浓度分别为400（设为Tl）、800 （T2）、1200 （T3）、1600 （T4）及2000 （T5） μmol/L，用于真菌对苯甲酸降解测定。
1.2 真菌的分离与纯化
真菌按照常规方法进行分离和纯化：按照文献方法制备烤烟根系分泌物，取lmL烤烟根系分泌物均匀涂布于马丁氏培养基中，28℃黑暗条件下培养7d。在菌落形成后挑取单个菌落置于以苯甲酸为唯一碳源的固体真菌培养基中，28℃黑暗条件下培养。待长出单菌落后，挑取单孢纯化，纯化后的菌株保存于LBA培养基斜面上，置4℃冰箱中保存备用。
1.3 真菌鉴定
1.3.1 形态学鉴定将分离纯化得到的真菌接种到LBA平板上，28℃黑暗培养，观察菌落形态；7d后从平板上挑取少量菌丝进行镜检，观察孢子形态及其产生方式。
1.3.2 rDNA-ITS扩增及序列分析将分离得到的真菌接种于LBA培养基中，在28℃黑暗条件下培养3d。用灭菌牙签挑取少量菌丝用于DNA提取。DNA提取参照Lee等的方法。利用真菌核糖体基因转录间隔区（ITS）通用引物ITSI （5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'） 对病原菌的rDNA-ITS区进行PCR扩增。扩增条件为94℃预变性5min；94℃变性lmin，57℃退火lmin，72℃延伸lmin，共30个循环；最终72℃延伸10min。PCR产物经I%琼脂糖凝胶电泳检测后，北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序，测序结果在GenBank数据库（www.ncbi.nlm.nih.gov）中进行BLAST比对分析。
1.4 降解菌液对烤烟幼苗生长的影响
幼苗生长试验于2013年8月至2013年10月，在贵州省烟草科学研究院人工大棚中进行，采用常规育苗盘育苗，育苗基质由云南省丘北县烟用物资有限责任公司提供。8月1日开始播种，育苗15d后间苗（8月15日），间苗后每穴留有l株烟苗，后向育苗盘中每天下午浇入50mL相应处理液，连续灌浇45d，含有降解菌的处理液在浇入前12h即在常温下混匀。采用随机区组设计，共设3个处理液处理，每个处理3个重复（即3盘幼苗），每个重复12株烟苗。3个处理中Ml处理为自来水设为CK，M2处理为烤烟根系分泌物，M3处理为降解菌液和烤烟根系分泌物的混合液。M3处理的混合处理液以降解菌液5mL，分泌物45mL进行分配。待幼苗生长60d（10月1日）后测量其根系结构、叶绿素含量和光合特性等各类指标。
1.5 测定项目
1.5.1 降解菌干重和苯甲酸降解速率测定在马丁氏培养基中取5mm降解菌菌丝块无菌操作移到T1-T5等5个以苯甲酸为唯一碳源浓度处理溶液培养基中进行培养，每个处理3个重复，连续培养15d。在降解菌培养至15d时取出降解真菌，过滤、干燥（60℃，2h）、称量，同时每隔3d测量一次不同浓度LBA培养基中苯甲酸含量，连续测量15d。苯甲酸含量测定采用文献方法测量，并称量。
1.5.2 烤烟幼苗生长相关生理指标测定选取长相一致具有代表性的烟苗根系，采用WinRHIZO植物根系扫描分析系统（北京易科泰生态技术有限公司）测定幼苗根系结构。采用Li-6400XT便携式光合作用测定仪和6400-02B红蓝光源（美国Li-cor公司）测定幼苗光合指标。采用丙酮提取一TU1901紫外分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）测定幼苗叶绿素各类指标。 试验数据采用Microsoft Excel 2003软件进行处理，采用SPSS18.0软件进行差异显著性分析。
2 结果
2.1 降解菌株鉴定
2.1.1 降解菌株的菌落形态特征观察 降解菌在LBA培养基上生长良好，菌落生长较快，结构疏松，表面灰绿色，背面无色或略呈褐色（图l-D）。菌体有许多复杂的分枝菌丝构成（图l-A）。营养菌丝具有分隔；气生菌丝的一部分形成长而粗糙的分生孢子梗，顶端产生烧瓶形或近球形顶囊（图I-C），表面产生许多小梗，小梗上着生成串的表面粗糙的球形分生孢子（图l-B）。具典型的黄曲霉形态特征。
2.1.2 菌株25序列测定采用真菌鉴定通用引物ITSI/ITS4对该菌株进行rDNA-ITS的PCR扩增，经测序分析该菌株ITS序列片段长589bp（Genbank收录号为KT633952）。BLAST分析表明，该菌株的rDNA-ITS序列与GenBank中FJ878681、HQ340108、HQ340103、HQ340101等黄曲霉序列的相似性最高，达到99%。
综合上述的形态学观察及ITS序列数据，将该降解菌初步鉴定为黄曲霉菌（Aspergillusflavus）。
2.2 菌株对苯甲酸降解的影响
2.2.1 不同浓度苯甲酸对菌株干重的影响 图2可知，降解菌株在苯甲酸溶液中经过15d培养后干重随浓度的增加呈先增大后降低的趋势。苯甲酸干重在T2处理中达到最大，为0.765g，与其他处理差异显著；在T3、T4和T5处理浓度中干重显著降低，且3个处理间无显著性差异。
2.2.2 菌株对苯甲酸降解速率的影响 图3可知，降解菌在Tl和T2处理浓度下苯甲酸的降解速率呈先上升后降低的趋势，在第9天时降解速率达到最大，分别为2.7和8.5mg/d，然后逐渐降低，在第15d时两个浓度处理下苯甲酸的降解速率趋于相同，分别为1.31和1.2mg/d，其他处理浓度下基本不降解。
2.3 降解菌液对烤烟幼苗根系结构的影响
表l可知，各处理间以MI处理的烤烟幼苗根系生长最好，与M2和M3处理的各类根系结构指标有显著性差异；M2与M3处理除总根表面积有显著性差异，其他指标均无显著性差异，但M3处理烤烟根系生长优于M2处理。说明，根系分泌物中加入降解菌后能够在一定程度上降低根系分泌物对烤烟根系生长的抑制作用。
2.4 降解菌液对烤烟幼苗叶绿素含量的影响
表2可知，灌浇不同处理液后对烤烟幼苗生长过程中叶绿素含量的影响不同。其中，M1处理较M2和M3处理在叶绿素各类指标中均为最大，且差异性显著，M2和M3处理间虽无显著性差异，但M3处理叶绿素含量有高于M2处理的趋势。
2.5 降解菌液对烤烟幼苗光合特性的影响
表3可知，含有降解菌处理液的M3处理能够减缓根系分泌物对烤烟生长过程中光合特性的抑制作用。各处理间光合特性以MI>M2>M3，Ml处理与M2和M3处理间呈显著性差异，M2和M3处理的净光合速率呈显著性差异，但气孔导度、蒸腾速率以及胞间CO2浓度无差异或差异不显著。
3 讨论
烤烟根系分泌物造成的烤烟连作障碍是近年来我国主要植烟区遇到的常见问题，连作障碍往往会导致病虫害加重、土壤次生盐渍化及酸化、植物自毒作用和元素平衡破坏等。Asao T等认为导致烤烟连作障碍的一个重要原因是由于本身的自毒作用，由于连年种植，导致烤烟根系会分泌一些自毒物质并积累，达到一定程度会抑制烤烟生长。化感物质可以对受体植物的细胞分裂、膜功能、光合作用和生物合成等生理生化反应产生影响。笔者从烤烟根系分泌物中分离出一株能够降解苯甲酸的菌株，采用形态学观察和rDNA-ITS的扩增及序列分析对其进行鉴定，初步将其鉴定为黄曲霉（aspergillus.flavus），并对其降解效果进行了研究。研究结果对解决当前植烟土壤连作障碍有一定的现实意义。
关于苯甲酸降解菌的研究并不多见，方艳芬等采用富集培养法从废水中分离到能以苯甲酸为唯一碳源和能源的菌株LSOI，在最适宜条件下，菌株的降解率能达到85%以上；蔡宝立等用富集培养法从工业污水中分离出不动杆菌（Acinetobacter sp.）BJI、无色杆菌（Achromobactersp.） BYI、假单胞菌（Paesdomonas.9pp.）SJI、SYI和SHI等5株能够降解苯甲酸的微生物，在最适条件下BJI菌株对苯甲酸的降解率达到98%以上。苯甲酸是多种芳香化合物生物代谢的中间产物，研究发现，好氧微生物降解苯甲酸主要通过邻位代谢途径、间位代谢途径以及苯甲酰辅酶A和3-羟基苯甲酰辅酶A代谢途径，分别将苯甲酸分解为生理反应各阶段中间物质。国内外未见黄曲霉具有这种降解特性的报道，其降解机理有待进一步研究。
黄曲霉（Aspergillusflavus）对苯甲酸的降解效果研究表明，黄曲霉在以苯甲酸为唯一碳源在800μμmol/L浓度时生长条件最佳，苯甲酸降解率可达19.98%，在第9天时降解速率最快。进一步将黄曲霉培养后与烤烟根系分泌物混合施加到育苗盘中进行烤烟幼苗培养，能减轻根系分泌物对烤烟幼苗根系结构、叶绿素含量以及光合特性等指标的抑制作用，说明根系分泌物中施加降解菌液一定程度上弱化根系分泌物对烤烟幼苗的化感效应。与本研究结果相似，胡春江等研究发现，在土壤中施加微生物修复菌物可以有效减轻作物连作障碍。上述研究结果表明微生物降解作物自毒物质，有助于克服连作障碍。此外，本文只研究了一种降解菌液与烤烟根系分泌物混合对烤烟幼苗生长的影响，要解决大田烤烟连作障碍，还需进一步分离鉴定更多根系分泌物降解菌株并进行大田试验研究。
关键词：烤烟；苯甲酸降解菌；分离鉴定；连作障碍
中图分类号：S345.72
文章编号：1007-5119（2016）01-0072-06
DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2016.01.013
鉴于我国农田种植制度、土地流转方式及经济效益方面的考虑，烟草连作障碍依然普遍，已成为制约我国烟草农业发展的障碍之一。烤烟根系在生长过程中会分泌一些有害物质，在土壤中积累到一定程度时会抑制烤烟本身及其他作物的生长，同时导致土壤理化性状恶化、土传病害日趋严重。烤烟根系分泌物释放的烟碱、水杨酸、苯甲酸、2-羟基丙酸等均可降低植烟土壤利用率和烟叶品质。有研究报道，采用作物轮作、施用土壤改良剂和微生物肥料等方法，可以缓解由于营养元素失衡和土传病害增多引起的连作现象，但关于烤烟自毒物质的生物可降解性报道还不多见，只有毛宁等、苗艳芳等和周治等对植物根系分泌物降解菌有少许研究。上述研究主要针对细菌和放线菌，关于真菌的研究较少，尤其真菌对苯甲酸降解效果研究未见报道。本研究针对烤烟连作自毒作用的生物降解菌进行分离筛选，对分离的菌株进行分子生物学鉴定，并进行盆栽试验验证其降解效果，进一步探讨利用微生物菌株降解烤烟自毒物质的可行性，为烤烟连作障碍修复提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 供试培养基
真菌培养选用马丁氏培养基，活化培养及保存方法参照文献以苯甲酸为唯一碳源真菌培养基：磷酸二氢钾Ig，七水硫酸镁0.5g，1/300孟加拉红水溶液3mL，pH自然，定容至IL，固体培养基用于降解苯甲酸真菌的筛选；液体培养基分装后，加入苯甲酸，使苯甲酸的终浓度分别为400（设为Tl）、800 （T2）、1200 （T3）、1600 （T4）及2000 （T5） μmol/L，用于真菌对苯甲酸降解测定。
1.2 真菌的分离与纯化
真菌按照常规方法进行分离和纯化：按照文献方法制备烤烟根系分泌物，取lmL烤烟根系分泌物均匀涂布于马丁氏培养基中，28℃黑暗条件下培养7d。在菌落形成后挑取单个菌落置于以苯甲酸为唯一碳源的固体真菌培养基中，28℃黑暗条件下培养。待长出单菌落后，挑取单孢纯化，纯化后的菌株保存于LBA培养基斜面上，置4℃冰箱中保存备用。
1.3 真菌鉴定
1.3.1 形态学鉴定将分离纯化得到的真菌接种到LBA平板上，28℃黑暗培养，观察菌落形态；7d后从平板上挑取少量菌丝进行镜检，观察孢子形态及其产生方式。
1.3.2 rDNA-ITS扩增及序列分析将分离得到的真菌接种于LBA培养基中，在28℃黑暗条件下培养3d。用灭菌牙签挑取少量菌丝用于DNA提取。DNA提取参照Lee等的方法。利用真菌核糖体基因转录间隔区（ITS）通用引物ITSI （5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'） 对病原菌的rDNA-ITS区进行PCR扩增。扩增条件为94℃预变性5min；94℃变性lmin，57℃退火lmin，72℃延伸lmin，共30个循环；最终72℃延伸10min。PCR产物经I%琼脂糖凝胶电泳检测后，北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序，测序结果在GenBank数据库（www.ncbi.nlm.nih.gov）中进行BLAST比对分析。
1.4 降解菌液对烤烟幼苗生长的影响
幼苗生长试验于2013年8月至2013年10月，在贵州省烟草科学研究院人工大棚中进行，采用常规育苗盘育苗，育苗基质由云南省丘北县烟用物资有限责任公司提供。8月1日开始播种，育苗15d后间苗（8月15日），间苗后每穴留有l株烟苗，后向育苗盘中每天下午浇入50mL相应处理液，连续灌浇45d，含有降解菌的处理液在浇入前12h即在常温下混匀。采用随机区组设计，共设3个处理液处理，每个处理3个重复（即3盘幼苗），每个重复12株烟苗。3个处理中Ml处理为自来水设为CK，M2处理为烤烟根系分泌物，M3处理为降解菌液和烤烟根系分泌物的混合液。M3处理的混合处理液以降解菌液5mL，分泌物45mL进行分配。待幼苗生长60d（10月1日）后测量其根系结构、叶绿素含量和光合特性等各类指标。
1.5 测定项目
1.5.1 降解菌干重和苯甲酸降解速率测定在马丁氏培养基中取5mm降解菌菌丝块无菌操作移到T1-T5等5个以苯甲酸为唯一碳源浓度处理溶液培养基中进行培养，每个处理3个重复，连续培养15d。在降解菌培养至15d时取出降解真菌，过滤、干燥（60℃，2h）、称量，同时每隔3d测量一次不同浓度LBA培养基中苯甲酸含量，连续测量15d。苯甲酸含量测定采用文献方法测量，并称量。
1.5.2 烤烟幼苗生长相关生理指标测定选取长相一致具有代表性的烟苗根系，采用WinRHIZO植物根系扫描分析系统（北京易科泰生态技术有限公司）测定幼苗根系结构。采用Li-6400XT便携式光合作用测定仪和6400-02B红蓝光源（美国Li-cor公司）测定幼苗光合指标。采用丙酮提取一TU1901紫外分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）测定幼苗叶绿素各类指标。 试验数据采用Microsoft Excel 2003软件进行处理，采用SPSS18.0软件进行差异显著性分析。
2 结果
2.1 降解菌株鉴定
2.1.1 降解菌株的菌落形态特征观察 降解菌在LBA培养基上生长良好，菌落生长较快，结构疏松，表面灰绿色，背面无色或略呈褐色（图l-D）。菌体有许多复杂的分枝菌丝构成（图l-A）。营养菌丝具有分隔；气生菌丝的一部分形成长而粗糙的分生孢子梗，顶端产生烧瓶形或近球形顶囊（图I-C），表面产生许多小梗，小梗上着生成串的表面粗糙的球形分生孢子（图l-B）。具典型的黄曲霉形态特征。
2.1.2 菌株25序列测定采用真菌鉴定通用引物ITSI/ITS4对该菌株进行rDNA-ITS的PCR扩增，经测序分析该菌株ITS序列片段长589bp（Genbank收录号为KT633952）。BLAST分析表明，该菌株的rDNA-ITS序列与GenBank中FJ878681、HQ340108、HQ340103、HQ340101等黄曲霉序列的相似性最高，达到99%。
综合上述的形态学观察及ITS序列数据，将该降解菌初步鉴定为黄曲霉菌（Aspergillusflavus）。
2.2 菌株对苯甲酸降解的影响
2.2.1 不同浓度苯甲酸对菌株干重的影响 图2可知，降解菌株在苯甲酸溶液中经过15d培养后干重随浓度的增加呈先增大后降低的趋势。苯甲酸干重在T2处理中达到最大，为0.765g，与其他处理差异显著；在T3、T4和T5处理浓度中干重显著降低，且3个处理间无显著性差异。
2.2.2 菌株对苯甲酸降解速率的影响 图3可知，降解菌在Tl和T2处理浓度下苯甲酸的降解速率呈先上升后降低的趋势，在第9天时降解速率达到最大，分别为2.7和8.5mg/d，然后逐渐降低，在第15d时两个浓度处理下苯甲酸的降解速率趋于相同，分别为1.31和1.2mg/d，其他处理浓度下基本不降解。
2.3 降解菌液对烤烟幼苗根系结构的影响
表l可知，各处理间以MI处理的烤烟幼苗根系生长最好，与M2和M3处理的各类根系结构指标有显著性差异；M2与M3处理除总根表面积有显著性差异，其他指标均无显著性差异，但M3处理烤烟根系生长优于M2处理。说明，根系分泌物中加入降解菌后能够在一定程度上降低根系分泌物对烤烟根系生长的抑制作用。
2.4 降解菌液对烤烟幼苗叶绿素含量的影响
表2可知，灌浇不同处理液后对烤烟幼苗生长过程中叶绿素含量的影响不同。其中，M1处理较M2和M3处理在叶绿素各类指标中均为最大，且差异性显著，M2和M3处理间虽无显著性差异，但M3处理叶绿素含量有高于M2处理的趋势。
2.5 降解菌液对烤烟幼苗光合特性的影响
表3可知，含有降解菌处理液的M3处理能够减缓根系分泌物对烤烟生长过程中光合特性的抑制作用。各处理间光合特性以MI>M2>M3，Ml处理与M2和M3处理间呈显著性差异，M2和M3处理的净光合速率呈显著性差异，但气孔导度、蒸腾速率以及胞间CO2浓度无差异或差异不显著。
3 讨论
烤烟根系分泌物造成的烤烟连作障碍是近年来我国主要植烟区遇到的常见问题，连作障碍往往会导致病虫害加重、土壤次生盐渍化及酸化、植物自毒作用和元素平衡破坏等。Asao T等认为导致烤烟连作障碍的一个重要原因是由于本身的自毒作用，由于连年种植，导致烤烟根系会分泌一些自毒物质并积累，达到一定程度会抑制烤烟生长。化感物质可以对受体植物的细胞分裂、膜功能、光合作用和生物合成等生理生化反应产生影响。笔者从烤烟根系分泌物中分离出一株能够降解苯甲酸的菌株，采用形态学观察和rDNA-ITS的扩增及序列分析对其进行鉴定，初步将其鉴定为黄曲霉（aspergillus.flavus），并对其降解效果进行了研究。研究结果对解决当前植烟土壤连作障碍有一定的现实意义。
关于苯甲酸降解菌的研究并不多见，方艳芬等采用富集培养法从废水中分离到能以苯甲酸为唯一碳源和能源的菌株LSOI，在最适宜条件下，菌株的降解率能达到85%以上；蔡宝立等用富集培养法从工业污水中分离出不动杆菌（Acinetobacter sp.）BJI、无色杆菌（Achromobactersp.） BYI、假单胞菌（Paesdomonas.9pp.）SJI、SYI和SHI等5株能够降解苯甲酸的微生物，在最适条件下BJI菌株对苯甲酸的降解率达到98%以上。苯甲酸是多种芳香化合物生物代谢的中间产物，研究发现，好氧微生物降解苯甲酸主要通过邻位代谢途径、间位代谢途径以及苯甲酰辅酶A和3-羟基苯甲酰辅酶A代谢途径，分别将苯甲酸分解为生理反应各阶段中间物质。国内外未见黄曲霉具有这种降解特性的报道，其降解机理有待进一步研究。
黄曲霉（Aspergillusflavus）对苯甲酸的降解效果研究表明，黄曲霉在以苯甲酸为唯一碳源在800μμmol/L浓度时生长条件最佳，苯甲酸降解率可达19.98%，在第9天时降解速率最快。进一步将黄曲霉培养后与烤烟根系分泌物混合施加到育苗盘中进行烤烟幼苗培养，能减轻根系分泌物对烤烟幼苗根系结构、叶绿素含量以及光合特性等指标的抑制作用，说明根系分泌物中施加降解菌液一定程度上弱化根系分泌物对烤烟幼苗的化感效应。与本研究结果相似，胡春江等研究发现，在土壤中施加微生物修复菌物可以有效减轻作物连作障碍。上述研究结果表明微生物降解作物自毒物质，有助于克服连作障碍。此外，本文只研究了一种降解菌液与烤烟根系分泌物混合对烤烟幼苗生长的影响，要解决大田烤烟连作障碍，还需进一步分离鉴定更多根系分泌物降解菌株并进行大田试验研究。