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【摘 要】氨基甲酸乙酯（Ethyl Carbamate，EC）是一种基因致癌物，黄酒及其它发酵酒中含有微量的氨基甲酸乙酯。持续6年跟踪检测常温存储下的同种坛装黄酒中氨基甲酸乙酯，PH值及酸度值，检测结果表明随着时间推移氨基甲酸乙酯的含量明显上升，PH值及酸度值基本不变。长期常温存储存在导致氨基甲酸乙酯超过基准值的风险，需添加一定物质减缓氨基甲酸乙酯生成速率。
【关键词】黄酒；氨基甲酸乙酯；PH值；酸度值
氨基甲酸乙酯（Ethyl Carbamate，EC）早在1943年就被Nettleshi证实为致癌物质[1]。目前，氨基甲酸乙酯的污染被认为是食品中继黄曲霉毒素后又一重大问题。2007年4月10日，世界卫生组织的国际癌症研究机构（IARC）正式将氨基甲酸乙酯归为2A类致癌物质，与丙烯酰胺同等危险[2]。氨基甲酸乙酯已经成为2002年联合国粮农组织重点监控物质，并制定了国际标准，其含量不得超过20ug/L[3-4]。黄酒属于酿造酒，我国尚未制定酒精饮料和发酵食品中EC的限量值。目前对EC的限定值也在积极酝酿之中，据中国黄酒协会的消息，中国对黄酒中的EC含量将设定标准为0.120mg/L-0.150mg/L。跟踪调查存储坛装黄酒中的EC值，pH值及酸度，了解在存储过程中各数值的变化，为指导合理存储坛装黄酒提供数据参考。
1、材料与方法
1.1材料与仪器
黄酒样品市售8种不同年份，不同种类的坛装黄酒；EC标准品 纯度>99.0%，Sigma-Aldrich公司；纯度>98.5%，Sigma-Aldrich公司；二氯甲烷，乙腈，正己烷，乙酸乙酯均为色谱纯；氯化钠，氢氧化钠为分析纯。
气相色谱-质谱联用仪GC/MS：Thermo Trace GC ultra—DSQ，美国Finnigan公司生产；配备HP-INNOWAX极性色谱柱（30m × 0.25mm×0.5μm，美国J&W公司）。
pH计：HORIBA制 pH/ION METER F-24；pH电极：HORIBA制 9611-10D
酸度计：Model 420A，Therom Orin。
1.2实验方法
1.2.1溶液配制
标准溶液：准确称取适量的氨基甲酸乙酯标准物质，用乙腈配成浓度为100ug/ml的标准储备液。根据需要用乙腈稀释至适当浓度的标准工作液。标准储备液在0℃-4℃度冰箱中保存，有效期为12个月，标准工作液在0℃-4℃度冰箱中保存，有效期为6个月。
1.2.2样品处理
取样工具于120℃灭菌20min，后在55℃烘1-2hrs。从酒坛中取样1.0 g（精确到0.01 g）于10 mL离心管中，加水调节样品的酒精度至25度（酒精度低于25度的样品不再稀释），加0.4g氯化钠，混合使溶解，加等体积的正己烷，于涡旋混合器上混合1min，2000r/min离心2min，用尖嘴吸管吸出正己烷相，弃去。然后用2×2mL二氯甲烷提取，于涡旋混合上混匀1min，2000r/min离心2min，用尖嘴吸管吸出二氯甲烷层，合并转入洁净的5mL离心管中。于30℃水浴中，氮氣缓流下浓缩到0.2mL，加乙酸乙酯定容到0.5mL，供GC/MS测定[5]。
1.2.3GC/MS条件
1.2.3.1气相条件
色谱柱HP-INNOWAX30m×0.25mm×0.5μm，进样口温度190℃，柱温程序：初温40℃，保持2min，然后以10℃/min升至180℃，保持0.5min，再以5℃/min的速度升至220℃，保持4min。载气为高纯氦气，体积流量1.0mL/min，不分流进样，进样体积1μl。
1.2.3.2质谱条件
离子源温度220℃；电子能量70eV；接口温度220℃；电子倍增电压1568 V；检测离子m/z 62、74、89，定量离子m/z62。
1.2.3检测pH值
取样工具于120℃灭菌20min，后在55℃烘1～2hrs。从酒坛中取样后，使用pH计直接检测。
1.2.4检测酸度（以乳酸计）
吸取试样10.0ml于150ml烧杯中，加入无二氧化碳的水50ml。烧杯中放入磁力搅拌棒，置于电磁搅拌器上，开启搅拌，用0.1mol/L NaOH标准溶液滴定，开始时可快速滴加0.1mol/L NaOH标准溶液，当滴定至pH等于7.0时，放慢滴定速度，每次加半滴0.1mol/L NaOH标准溶液，直至pH等于8.20为终点。记录消耗0.1mol/L NaOH标准溶液的体积（V1）。同时做空白试验，记录试验消耗0.1mol/L NaOH标准溶液的体积（V0）[6]。
2、结果与讨论
2.1标准曲线和回归方程
将不同浓度的氨基甲酸乙酯标准溶液从低浓度到高浓度依次进样，做标准曲线和相关系数，其回归方程为Y=6.39875e-0.01x（Y：峰面积，mV·S；X：含量，mg/L），相关系数R2=0.9998。
2.2样品回收率与精密度的测定
取1mL黄酒样品分别加标20ug/L、100ug/L，分别测定加标样品和未加标样品的氨基甲酸乙酯含量，根据加入量和检出量计算回收率，结果见表1。
由表1可知，回收率在84.9%一90.1%之间，相对标准偏差（RSD）为1.7%、1.8%，方法的准确度较高。
2.3黄酒氨基甲酸乙酯值、pH值、酸度的检测值
2.3.1氨基甲酸乙酯浓度变化
2006年至2012年的六年内按照上述方法每年测定代表各年份不同种类的8种黄酒：冬酿女儿红，女儿红，东风加饭酒中的氨基甲酸乙酯值进行了检测，含量变化趋势如图1所示。 在常温的存储条件下，形成氨基甲酸乙酯的反应仍然在进行中。6年间同种酒中EC含量分别增长2-6倍不等。
2.3.2PH值变化
按照上述方法对8个不同黄酒中的PH值進行了检测，检测值见表2。
同一坛装酒pH值数值变化在±0.3内，基本稳定，在储酒过程中pH基本无明显变化。
2.3.3酸度（以乳酸计）变化
按照上述方法对8个不同黄酒中的酸度值进行了检测，含量检测值见表3。
连续6次测定代表各年度同一坛装酒的酸度值（以乳酸计）基本无明显变化。
3、讨论
EA的生成量与反应温度有关，温度高会使EC的含量增加。贮存坛装酒样品的温度常年达到20℃-30℃，导致坛装酒中EC含量每年以一定的速度增长。以样品05年东风加饭酒为例，2006年检测值为0.072mg/L，2012年分析值为0.251mg/L，较06年EC值增长3.5倍，超出0.200mg/L。氨基甲酸乙酯已经引起了世界各国的普遍关注，因此当前迫切需要对我国酒类氨基甲酸乙酯制定限量标准，同时长期常温存储存会导致氨基甲酸乙酯超过基准值，需进一步对降低氨基甲酸乙酯的生成做深入的调查和研究，添加一定物质以减缓氨基甲酸乙酯生成速率。
参考文献
[1]陆建，曹钰.葡萄酒中氨基甲酸乙酯的研究[J].食品与发酵工艺，1996（3）：79-82.
[2]宋钢.酒类的安全性调查-氨基甲酸乙酯的检测[J].中国酿造，2008，180（3）：99-102.
[3]高年发，宝菊花.氨基甲酸乙酯的研究进展[J].中国酿造，2006，（9）：l-4.
[4]高年发，刘欠欠，韩德新等.氨基甲酸乙酯含量随葡萄酒酿造过程变化趋势的研究[J].食品工业科技，2010，31（07）：191-193
[5]自强，杨建民，徐亮.出口酒类中氨基甲酸乙酯残留量检测方法[M].中华人民共和国国家进出口商品检疫局，1993.
[6]GB/T 13662-2008 黄酒[S]
作者简介
蒋燕华，1981.10，女，毕业院校：华东理工大学生物工程系，学历：本科，研究方向为食品质量监督检测 职务：工程师。
【关键词】黄酒；氨基甲酸乙酯；PH值；酸度值
氨基甲酸乙酯（Ethyl Carbamate，EC）早在1943年就被Nettleshi证实为致癌物质[1]。目前，氨基甲酸乙酯的污染被认为是食品中继黄曲霉毒素后又一重大问题。2007年4月10日，世界卫生组织的国际癌症研究机构（IARC）正式将氨基甲酸乙酯归为2A类致癌物质，与丙烯酰胺同等危险[2]。氨基甲酸乙酯已经成为2002年联合国粮农组织重点监控物质，并制定了国际标准，其含量不得超过20ug/L[3-4]。黄酒属于酿造酒，我国尚未制定酒精饮料和发酵食品中EC的限量值。目前对EC的限定值也在积极酝酿之中，据中国黄酒协会的消息，中国对黄酒中的EC含量将设定标准为0.120mg/L-0.150mg/L。跟踪调查存储坛装黄酒中的EC值，pH值及酸度，了解在存储过程中各数值的变化，为指导合理存储坛装黄酒提供数据参考。
1、材料与方法
1.1材料与仪器
黄酒样品市售8种不同年份，不同种类的坛装黄酒；EC标准品 纯度>99.0%，Sigma-Aldrich公司；纯度>98.5%，Sigma-Aldrich公司；二氯甲烷，乙腈，正己烷，乙酸乙酯均为色谱纯；氯化钠，氢氧化钠为分析纯。
气相色谱-质谱联用仪GC/MS：Thermo Trace GC ultra—DSQ，美国Finnigan公司生产；配备HP-INNOWAX极性色谱柱（30m × 0.25mm×0.5μm，美国J&W公司）。
pH计：HORIBA制 pH/ION METER F-24；pH电极：HORIBA制 9611-10D
酸度计：Model 420A，Therom Orin。
1.2实验方法
1.2.1溶液配制
标准溶液：准确称取适量的氨基甲酸乙酯标准物质，用乙腈配成浓度为100ug/ml的标准储备液。根据需要用乙腈稀释至适当浓度的标准工作液。标准储备液在0℃-4℃度冰箱中保存，有效期为12个月，标准工作液在0℃-4℃度冰箱中保存，有效期为6个月。
1.2.2样品处理
取样工具于120℃灭菌20min，后在55℃烘1-2hrs。从酒坛中取样1.0 g（精确到0.01 g）于10 mL离心管中，加水调节样品的酒精度至25度（酒精度低于25度的样品不再稀释），加0.4g氯化钠，混合使溶解，加等体积的正己烷，于涡旋混合器上混合1min，2000r/min离心2min，用尖嘴吸管吸出正己烷相，弃去。然后用2×2mL二氯甲烷提取，于涡旋混合上混匀1min，2000r/min离心2min，用尖嘴吸管吸出二氯甲烷层，合并转入洁净的5mL离心管中。于30℃水浴中，氮氣缓流下浓缩到0.2mL，加乙酸乙酯定容到0.5mL，供GC/MS测定[5]。
1.2.3GC/MS条件
1.2.3.1气相条件
色谱柱HP-INNOWAX30m×0.25mm×0.5μm，进样口温度190℃，柱温程序：初温40℃，保持2min，然后以10℃/min升至180℃，保持0.5min，再以5℃/min的速度升至220℃，保持4min。载气为高纯氦气，体积流量1.0mL/min，不分流进样，进样体积1μl。
1.2.3.2质谱条件
离子源温度220℃；电子能量70eV；接口温度220℃；电子倍增电压1568 V；检测离子m/z 62、74、89，定量离子m/z62。
1.2.3检测pH值
取样工具于120℃灭菌20min，后在55℃烘1～2hrs。从酒坛中取样后，使用pH计直接检测。
1.2.4检测酸度（以乳酸计）
吸取试样10.0ml于150ml烧杯中，加入无二氧化碳的水50ml。烧杯中放入磁力搅拌棒，置于电磁搅拌器上，开启搅拌，用0.1mol/L NaOH标准溶液滴定，开始时可快速滴加0.1mol/L NaOH标准溶液，当滴定至pH等于7.0时，放慢滴定速度，每次加半滴0.1mol/L NaOH标准溶液，直至pH等于8.20为终点。记录消耗0.1mol/L NaOH标准溶液的体积（V1）。同时做空白试验，记录试验消耗0.1mol/L NaOH标准溶液的体积（V0）[6]。
2、结果与讨论
2.1标准曲线和回归方程
将不同浓度的氨基甲酸乙酯标准溶液从低浓度到高浓度依次进样，做标准曲线和相关系数，其回归方程为Y=6.39875e-0.01x（Y：峰面积，mV·S；X：含量，mg/L），相关系数R2=0.9998。
2.2样品回收率与精密度的测定
取1mL黄酒样品分别加标20ug/L、100ug/L，分别测定加标样品和未加标样品的氨基甲酸乙酯含量，根据加入量和检出量计算回收率，结果见表1。
由表1可知，回收率在84.9%一90.1%之间，相对标准偏差（RSD）为1.7%、1.8%，方法的准确度较高。
2.3黄酒氨基甲酸乙酯值、pH值、酸度的检测值
2.3.1氨基甲酸乙酯浓度变化
2006年至2012年的六年内按照上述方法每年测定代表各年份不同种类的8种黄酒：冬酿女儿红，女儿红，东风加饭酒中的氨基甲酸乙酯值进行了检测，含量变化趋势如图1所示。 在常温的存储条件下，形成氨基甲酸乙酯的反应仍然在进行中。6年间同种酒中EC含量分别增长2-6倍不等。
2.3.2PH值变化
按照上述方法对8个不同黄酒中的PH值進行了检测，检测值见表2。
同一坛装酒pH值数值变化在±0.3内，基本稳定，在储酒过程中pH基本无明显变化。
2.3.3酸度（以乳酸计）变化
按照上述方法对8个不同黄酒中的酸度值进行了检测，含量检测值见表3。
连续6次测定代表各年度同一坛装酒的酸度值（以乳酸计）基本无明显变化。
3、讨论
EA的生成量与反应温度有关，温度高会使EC的含量增加。贮存坛装酒样品的温度常年达到20℃-30℃，导致坛装酒中EC含量每年以一定的速度增长。以样品05年东风加饭酒为例，2006年检测值为0.072mg/L，2012年分析值为0.251mg/L，较06年EC值增长3.5倍，超出0.200mg/L。氨基甲酸乙酯已经引起了世界各国的普遍关注，因此当前迫切需要对我国酒类氨基甲酸乙酯制定限量标准，同时长期常温存储存会导致氨基甲酸乙酯超过基准值，需进一步对降低氨基甲酸乙酯的生成做深入的调查和研究，添加一定物质以减缓氨基甲酸乙酯生成速率。
参考文献
[1]陆建，曹钰.葡萄酒中氨基甲酸乙酯的研究[J].食品与发酵工艺，1996（3）：79-82.
[2]宋钢.酒类的安全性调查-氨基甲酸乙酯的检测[J].中国酿造，2008，180（3）：99-102.
[3]高年发，宝菊花.氨基甲酸乙酯的研究进展[J].中国酿造，2006，（9）：l-4.
[4]高年发，刘欠欠，韩德新等.氨基甲酸乙酯含量随葡萄酒酿造过程变化趋势的研究[J].食品工业科技，2010，31（07）：191-193
[5]自强，杨建民，徐亮.出口酒类中氨基甲酸乙酯残留量检测方法[M].中华人民共和国国家进出口商品检疫局，1993.
[6]GB/T 13662-2008 黄酒[S]
作者简介
蒋燕华，1981.10，女，毕业院校：华东理工大学生物工程系，学历：本科，研究方向为食品质量监督检测 职务：工程师。