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摘 要：为了摸清山东省高致病性禽流感疫苗的质量情况，对2011年春季山东省3个中标厂家生产的重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗（H5N1，Re-5株+Re-4株）进行了质量检验和疫苗的抗体消长规律的跟踪。试验结果显示：除L厂家的2011010批次、G厂家的2011012批次有菌外，3个厂家的其余33批次灭活疫苗的物理性状、灭活检验和无菌检验均全部合格。免疫SPF鸡3周后，除Q厂家2011005批次疫苗外，其余34批疫苗HI抗体效价均≥60log2，产品达到质量标准要求。抗体消长规律实验表明，3个厂家的疫苗免疫SPF鸡4周即可达到高峰值， Re-4 HI抗体水平≥95log2， Re-5 HI抗体水平≥80log2，至25周时，仍维持在高抗体水平：Re-4 HI 抗体水平≥90log2， Re-5 HI 抗体水平≥78log2。从总的趋势看，L厂家的疫苗免疫抗体效价好于Q厂家和G厂家。
关键词：禽流感灭活疫苗；质量检测；抗体消长规律
中图分类号：S852.5+2（252） 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2012）12-0089-04
Antibody Response Dynamics and Quality Inspection of
Inactivated Avian Influenza Vaccines from
Shandong Government Tender in the Spring of 2011
Ai Wu， Qi LiHong， Wang ChunLing， Xu HuaiYing， Liu Tao， Li Feng， Yang YingGe， Wang LiLi*
（Institute of Poultry Science， Shandong Academy of Agricultural Sciences/ Key Laboratory
of Diagnosis and Immunity of Poultry Diseases of Shandong Province， Jinan 250023， China）
Abstract To inspect the quality of highly pathogenic avian influenza vaccines in Shandong province， the antibody response dynamics and the quality of bivalent inactivated avian Influenza vaccines of H5N1 subtype （strain Re-5+Re-4） from Shandong Government Tender was analyzed in this paper. The results showed that 33 batches inactivated vaccines from three manufacturers were qualified in physical properties， inactivation test， and sterility test except batch 2011010 from L manufacturer and batch 2011012 from G manufacturer. Three weeks after the first immunization， the antibody titers of the tested chickens were all over 6.0log2 except batch 2011005 from Q manufacturer. The antibody response dynamics test showed that all the HI titers stimulated by the vaccines from the three manufacturers could reach to the peak after 4 weeks from the first immunization，and the HI titers against Re-4 were higher than 9.5log2，while that against Re-5 were higher than 8.0log2. The antibody level against Re-4 and Re-5 remained high after 25 weeks， and the titers against Re-4 and Re-5 were higher than 9.0log2 and 7.8log2， respectively. It was found that the immune antibody titers stimulated with the products from L manufacturer were better than that of Q or G manufacturer.
Key words Avian influenza inactivated vaccine； Quality inspection； Antibody response dynamics
高致病性禽流感由A型流感病毒引起，主要發生于禽类呼吸系统，导致产蛋下降乃至急性致死和高死亡率的烈性传染病，世界动物卫生组织目前将其归为通报性高致病性禽流感，我国《动物防疫法》将其列为一类疫病[1，2]。2004年1月28日，我国政府对外公布了H5N1亚型高致病性禽流感病毒的疫情。高致病性禽流感的暴发流行，严重影响了养禽业的发展，给养禽业带来沉重的打击，并造成巨大的经济损失[3]。特别是H5N1亚型高致病性禽流感病毒能直接感染人并能导致死亡，引起了全世界的广泛关注。 为了有效预防和迅速控制H5亚型高致病性禽流感疫情，许多国家和地区采取了以扑杀、强制性免疫和生物安全相结合的扑灭措施，取得了良好的效果，世界卫生组织专家也建议免疫接种可作为扑杀的补充手段[3]。2004年我国规定对高致病性禽流感实行强制免疫，接种的疫苗实行政府招标。为了摸清山东省高致病性禽流感疫苗的质量情况，确保招标疫苗的免疫效果。本试验对2011年山东省3个中标厂家生产的重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗（H5N1，Re-5株+Re-4株）产品进行了质量检验和疫苗的抗体消长规律的跟踪。
1 材料与方法
11 供试材料
111 疫苗 来自3个中标厂家的重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗（H5N1，Re-5株+Re-4株），厂家名称分别用L、Q和G表示。具体批次见表1。
112 试验鸡 40日龄SPF鸡，由山东昊泰实验动物繁育有限公司提供。
113 禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验抗原 青岛易邦生物工程有限厂家生产，山东省动物疫病预防与控制中心惠赠。Re-5血凝抑制试验诊断抗原批号20110507，Re-4血凝抑制试验诊断抗原批号20110510。
114 试验地点 山东省农业科学院家禽研究所。
12 试验方法
121 抽样 根据《兽用生物制品批签发管理程序》规定，灭活疫苗每批次疫苗抽样10瓶，取其中5瓶进行检验，其余的5瓶存档。
122 物理性状检验 依照《中华人民共和国兽药典三部 2010年版》第13～14页规定方法，进行外观、剂型、稳定性及粘度检验。
123 无菌检验 每瓶灭活疫苗无菌操作取1 ml疫苗，加入到50 ml硫乙醇酸盐培养基中增菌3天，然后再接种2支硫乙醇酸盐（TG）小管、2支酪胨琼脂（GA）斜面和1支葡萄糖蛋白胨汤（GP）小管，观察5天。
124 灭活检验 待检各批次样品经尿囊腔途径接种10日龄SPF鸡胚10个，每胚接种02 ml，置36～37℃继续孵育，弃去24 h死亡鸡胚，观察至120 h，鸡胚非特异性死亡均不超过2个，检测鸡胚液的HA效价。
125 安全检验 每瓶疫苗用40日龄SPF鸡10只，各颈部皮下或胸部肌肉注射疫苗2羽份，观察14日。
126 效力检验 每个厂家的每批疫苗各取5瓶，每瓶疫苗用40日龄SPF鸡10只，各颈部皮下或肌肉注射疫苗1羽份，同時另设5只作对照。免疫后3周，每只鸡分别采血，分离血清，分别用Re-4和Re-5血凝抑制试验诊断抗原，测定HI抗体效价。
127 抗体消长规律的检测 每瓶疫苗用40日龄SPF鸡10只，每只各颈部皮下或肌肉注射疫苗1羽份，同时另设5只作对照。免疫后每周采血，分离血清，测定HI抗体效价，计算每批疫苗的几何平均指数，连续进行25周，分析抗体消长规律。
2 结果与分析
21 物理性状检验结果
211 外观 各样品均为白色乳剂。
212 剂型 取一清洁吸管，吸取少量待检成品滴于冷水中，各样品均呈油滴状，不扩散，为油包水型。
213 稳定性 各样品经离心检验均无分层现象。
214 粘度 各批次每个样品流出04 ml所需的时间均在8 s以内，符合规程标准。
22 无菌检验
除L厂家的2011010批次样品、G厂家的2011012批次产品在TG、GA和GP培养基上有细菌生长外，其余均未见细菌生长。
23 灭活检验
各批次样品均为阴性。
24 安全检验
观察14日，接种2羽份各批次样品的鸡只无全身反应，注射部位吸收较好，无眼观病变。
25 效力检验
各批次疫苗样品接种试验鸡3周后，采血检测抗体效价，对照鸡几何平均效价均低于2log2，免疫鸡HI抗体几何平均效价Re-4在975log2～1077log2之间， Re-5在796log2～895log2之间（详见表2）。
用L厂家的重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗（H5N1，Re-5株+Re-4株）免疫3周后Re-4抗体水平≥6log2比例达9947%，且Re-4 HI效价≥10log2的占89%；Re-5水平合格率达9857%，Re-5 HI效价≥9log2的占8065%（详见表3）。
用Q厂家疫苗免疫3周后Re-4 抗体水平≤5log2的占27%，合格率占973%，Re-5 HI效价≤5log2的占774%，合格率占9226%（详见表4）。造成不合格的主要原因是2011005批次疫苗检验的5瓶中有2瓶几何平均效价低于6的缘故，将这两瓶复检，结果同样是不合格。
用G厂家疫苗免疫3周后Re-4 HI抗体水平≤5log2的占511%，Re-4 HI抗体水平在6log2 ～9log2之间的占2847%，Re-4 HI效价≥10log2的占6569%，其中效价为10log2的最多占3066%，效价≥12log2的占803%；Re-5 HI效价≤5log2的占962%，6log2～8log2 之间的占5186%，Re-5 HI效价≥9log2的占3852%，其中效价为8log2的最多，占3111%， HI效价≥11log2的为0（见表5）。
26 抗体消长规律 疫苗免疫前及免疫后每周进行监测，观察禽流感Re-4 和Re-5的HI抗体效价，1～25周抗体详细结果见图1和图2。
SPF鸡免疫后第1周，3种疫苗免疫鸡的平均HI抗体均≤3log2，第2周除免疫Q厂家疫苗Re-5平均HI抗体≤6log2外，其余均≥6log2。三家禽流感二价苗免疫4周即可达到高峰值，免疫L厂家疫苗的Re-4可达到1090log2，Re-5可达到950log2，免疫Q厂家疫苗的Re-4可达到1010log2，Re-5可达到860log2，免疫G厂家疫苗的Re-4可达到975log2，Re-5可达到800log2，维持至25周后抗体水平逐渐下降，但仍≥8log2。从总的趋势看，免疫L厂家疫苗的抗体水平高于其他两家。免疫Q厂家和G厂家抗体水平相当。 3 小结与讨论
31 通过对3个厂家的35批次的重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗（H5N1，Re-5株+Re-4株）物理性狀全部合格。L厂家的批次为2011010、G厂家的批次为2011012在TG、GA和GP培养基上长菌外，其余均无菌。灭活检验全部合格。通过颈部皮下接种5周龄SPF鸡，每只2羽份，观察2周鸡只无不良反应，剖检试验鸡只，注射部位均吸收良好，证实疫苗是安全的。免疫效力试验结果表明，3家中标单位疫苗，免疫3周后，除Q厂家的批次为2011005的疫苗外，其余34批疫苗的Re-5 和Re-4 HI抗体效价均高于6log2，产品均达到质量标准要求。
32 比较3个厂家疫苗免疫3周后 HI抗体效价平均值可知，三厂家的Re-4抗体均比Re-5的水平高，L厂家Re-4抗体平均值比Re-5的水平高182log2，Q厂家Re-4抗体平均值比Re-5的水平高138log2，G厂家Re-4抗体平均值比Re-5的水平高179log2。
33 对3个厂家疫苗免疫3周后不同抗体水平的分布情况表和分布图分析可见：L厂家的免疫合格率最高，Q厂家的次之，最低的是G厂家。高抗体滴度所占比例也是L厂家的最高，Q厂家的Re-4低于G厂家，但就Re-5而言，Q厂家高抗体所占比例高于G厂家，且G厂家HI抗体效价没有达到11log2和12log2的。同时也能看出抗体L厂家的整齐度均高于其他两厂家。
34 从SPF鸡抗体消长规律可知， SPF鸡免疫后3周，免疫三家疫苗的HI抗体均≥796log2，4周即可达到高峰值，至25周时，仍维持在高抗体水平维持，Re-4抗体水平≥9log2， Re-5抗体水平≥779log2，同一家的疫苗Re-4抗体水平比Re-5抗体水平约高1个滴度。从总的趋势看，免疫L厂家疫苗的抗体水平高于其他两家，Q厂家和G厂家抗体水平相当。Re-4的抗体水平G厂家稍好于Q厂家，但Re-5的抗体水平Q厂家略高于G厂家（抗体消长规律试验仍在进行中）。
35 自2004年，我国政府对外公布了H5N1亚型高致病性禽流感病毒的疫情以来，规定对高致病性禽流感实行强制免疫，取得了一定的成效，但还存在各种各样的问题。长期以来，对招标禽流感疫苗的质量问题存在众多疑问。但从本试验对山东省35个批次的中标重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗（H5N1，Re-5株+Re-4株）质量检测结果显示，除1个批次疫苗外，免疫效果确实，免疫维持期较长，均达到或超过质量标准规定的要求。参 考 文 献：
[1] 甘孟侯禽流感（第2版）[M]北京：中国农业出版社， 2002
[2] 于康震 禽流感防控启示录[A]中国畜牧兽医学会禽病学分会第十四次学术研讨会论文集 [C]扬州：中国畜牧兽医学会禽病学分会编，2008
[3] 李明义，白志娟，宫 晓，等 禽流感H5亚型油乳剂灭活疫苗抗体消长规律的研究[J] 上海畜牧兽医通讯，2004，5：6-7 山 东 农 业 科 学 2012，44（12）：93～96，99
关键词：禽流感灭活疫苗；质量检测；抗体消长规律
中图分类号：S852.5+2（252） 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2012）12-0089-04
Antibody Response Dynamics and Quality Inspection of
Inactivated Avian Influenza Vaccines from
Shandong Government Tender in the Spring of 2011
Ai Wu， Qi LiHong， Wang ChunLing， Xu HuaiYing， Liu Tao， Li Feng， Yang YingGe， Wang LiLi*
（Institute of Poultry Science， Shandong Academy of Agricultural Sciences/ Key Laboratory
of Diagnosis and Immunity of Poultry Diseases of Shandong Province， Jinan 250023， China）
Abstract To inspect the quality of highly pathogenic avian influenza vaccines in Shandong province， the antibody response dynamics and the quality of bivalent inactivated avian Influenza vaccines of H5N1 subtype （strain Re-5+Re-4） from Shandong Government Tender was analyzed in this paper. The results showed that 33 batches inactivated vaccines from three manufacturers were qualified in physical properties， inactivation test， and sterility test except batch 2011010 from L manufacturer and batch 2011012 from G manufacturer. Three weeks after the first immunization， the antibody titers of the tested chickens were all over 6.0log2 except batch 2011005 from Q manufacturer. The antibody response dynamics test showed that all the HI titers stimulated by the vaccines from the three manufacturers could reach to the peak after 4 weeks from the first immunization，and the HI titers against Re-4 were higher than 9.5log2，while that against Re-5 were higher than 8.0log2. The antibody level against Re-4 and Re-5 remained high after 25 weeks， and the titers against Re-4 and Re-5 were higher than 9.0log2 and 7.8log2， respectively. It was found that the immune antibody titers stimulated with the products from L manufacturer were better than that of Q or G manufacturer.
Key words Avian influenza inactivated vaccine； Quality inspection； Antibody response dynamics
高致病性禽流感由A型流感病毒引起，主要發生于禽类呼吸系统，导致产蛋下降乃至急性致死和高死亡率的烈性传染病，世界动物卫生组织目前将其归为通报性高致病性禽流感，我国《动物防疫法》将其列为一类疫病[1，2]。2004年1月28日，我国政府对外公布了H5N1亚型高致病性禽流感病毒的疫情。高致病性禽流感的暴发流行，严重影响了养禽业的发展，给养禽业带来沉重的打击，并造成巨大的经济损失[3]。特别是H5N1亚型高致病性禽流感病毒能直接感染人并能导致死亡，引起了全世界的广泛关注。 为了有效预防和迅速控制H5亚型高致病性禽流感疫情，许多国家和地区采取了以扑杀、强制性免疫和生物安全相结合的扑灭措施，取得了良好的效果，世界卫生组织专家也建议免疫接种可作为扑杀的补充手段[3]。2004年我国规定对高致病性禽流感实行强制免疫，接种的疫苗实行政府招标。为了摸清山东省高致病性禽流感疫苗的质量情况，确保招标疫苗的免疫效果。本试验对2011年山东省3个中标厂家生产的重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗（H5N1，Re-5株+Re-4株）产品进行了质量检验和疫苗的抗体消长规律的跟踪。
1 材料与方法
11 供试材料
111 疫苗 来自3个中标厂家的重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗（H5N1，Re-5株+Re-4株），厂家名称分别用L、Q和G表示。具体批次见表1。
112 试验鸡 40日龄SPF鸡，由山东昊泰实验动物繁育有限公司提供。
113 禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验抗原 青岛易邦生物工程有限厂家生产，山东省动物疫病预防与控制中心惠赠。Re-5血凝抑制试验诊断抗原批号20110507，Re-4血凝抑制试验诊断抗原批号20110510。
114 试验地点 山东省农业科学院家禽研究所。
12 试验方法
121 抽样 根据《兽用生物制品批签发管理程序》规定，灭活疫苗每批次疫苗抽样10瓶，取其中5瓶进行检验，其余的5瓶存档。
122 物理性状检验 依照《中华人民共和国兽药典三部 2010年版》第13～14页规定方法，进行外观、剂型、稳定性及粘度检验。
123 无菌检验 每瓶灭活疫苗无菌操作取1 ml疫苗，加入到50 ml硫乙醇酸盐培养基中增菌3天，然后再接种2支硫乙醇酸盐（TG）小管、2支酪胨琼脂（GA）斜面和1支葡萄糖蛋白胨汤（GP）小管，观察5天。
124 灭活检验 待检各批次样品经尿囊腔途径接种10日龄SPF鸡胚10个，每胚接种02 ml，置36～37℃继续孵育，弃去24 h死亡鸡胚，观察至120 h，鸡胚非特异性死亡均不超过2个，检测鸡胚液的HA效价。
125 安全检验 每瓶疫苗用40日龄SPF鸡10只，各颈部皮下或胸部肌肉注射疫苗2羽份，观察14日。
126 效力检验 每个厂家的每批疫苗各取5瓶，每瓶疫苗用40日龄SPF鸡10只，各颈部皮下或肌肉注射疫苗1羽份，同時另设5只作对照。免疫后3周，每只鸡分别采血，分离血清，分别用Re-4和Re-5血凝抑制试验诊断抗原，测定HI抗体效价。
127 抗体消长规律的检测 每瓶疫苗用40日龄SPF鸡10只，每只各颈部皮下或肌肉注射疫苗1羽份，同时另设5只作对照。免疫后每周采血，分离血清，测定HI抗体效价，计算每批疫苗的几何平均指数，连续进行25周，分析抗体消长规律。
2 结果与分析
21 物理性状检验结果
211 外观 各样品均为白色乳剂。
212 剂型 取一清洁吸管，吸取少量待检成品滴于冷水中，各样品均呈油滴状，不扩散，为油包水型。
213 稳定性 各样品经离心检验均无分层现象。
214 粘度 各批次每个样品流出04 ml所需的时间均在8 s以内，符合规程标准。
22 无菌检验
除L厂家的2011010批次样品、G厂家的2011012批次产品在TG、GA和GP培养基上有细菌生长外，其余均未见细菌生长。
23 灭活检验
各批次样品均为阴性。
24 安全检验
观察14日，接种2羽份各批次样品的鸡只无全身反应，注射部位吸收较好，无眼观病变。
25 效力检验
各批次疫苗样品接种试验鸡3周后，采血检测抗体效价，对照鸡几何平均效价均低于2log2，免疫鸡HI抗体几何平均效价Re-4在975log2～1077log2之间， Re-5在796log2～895log2之间（详见表2）。
用L厂家的重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗（H5N1，Re-5株+Re-4株）免疫3周后Re-4抗体水平≥6log2比例达9947%，且Re-4 HI效价≥10log2的占89%；Re-5水平合格率达9857%，Re-5 HI效价≥9log2的占8065%（详见表3）。
用Q厂家疫苗免疫3周后Re-4 抗体水平≤5log2的占27%，合格率占973%，Re-5 HI效价≤5log2的占774%，合格率占9226%（详见表4）。造成不合格的主要原因是2011005批次疫苗检验的5瓶中有2瓶几何平均效价低于6的缘故，将这两瓶复检，结果同样是不合格。
用G厂家疫苗免疫3周后Re-4 HI抗体水平≤5log2的占511%，Re-4 HI抗体水平在6log2 ～9log2之间的占2847%，Re-4 HI效价≥10log2的占6569%，其中效价为10log2的最多占3066%，效价≥12log2的占803%；Re-5 HI效价≤5log2的占962%，6log2～8log2 之间的占5186%，Re-5 HI效价≥9log2的占3852%，其中效价为8log2的最多，占3111%， HI效价≥11log2的为0（见表5）。
26 抗体消长规律 疫苗免疫前及免疫后每周进行监测，观察禽流感Re-4 和Re-5的HI抗体效价，1～25周抗体详细结果见图1和图2。
SPF鸡免疫后第1周，3种疫苗免疫鸡的平均HI抗体均≤3log2，第2周除免疫Q厂家疫苗Re-5平均HI抗体≤6log2外，其余均≥6log2。三家禽流感二价苗免疫4周即可达到高峰值，免疫L厂家疫苗的Re-4可达到1090log2，Re-5可达到950log2，免疫Q厂家疫苗的Re-4可达到1010log2，Re-5可达到860log2，免疫G厂家疫苗的Re-4可达到975log2，Re-5可达到800log2，维持至25周后抗体水平逐渐下降，但仍≥8log2。从总的趋势看，免疫L厂家疫苗的抗体水平高于其他两家。免疫Q厂家和G厂家抗体水平相当。 3 小结与讨论
31 通过对3个厂家的35批次的重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗（H5N1，Re-5株+Re-4株）物理性狀全部合格。L厂家的批次为2011010、G厂家的批次为2011012在TG、GA和GP培养基上长菌外，其余均无菌。灭活检验全部合格。通过颈部皮下接种5周龄SPF鸡，每只2羽份，观察2周鸡只无不良反应，剖检试验鸡只，注射部位均吸收良好，证实疫苗是安全的。免疫效力试验结果表明，3家中标单位疫苗，免疫3周后，除Q厂家的批次为2011005的疫苗外，其余34批疫苗的Re-5 和Re-4 HI抗体效价均高于6log2，产品均达到质量标准要求。
32 比较3个厂家疫苗免疫3周后 HI抗体效价平均值可知，三厂家的Re-4抗体均比Re-5的水平高，L厂家Re-4抗体平均值比Re-5的水平高182log2，Q厂家Re-4抗体平均值比Re-5的水平高138log2，G厂家Re-4抗体平均值比Re-5的水平高179log2。
33 对3个厂家疫苗免疫3周后不同抗体水平的分布情况表和分布图分析可见：L厂家的免疫合格率最高，Q厂家的次之，最低的是G厂家。高抗体滴度所占比例也是L厂家的最高，Q厂家的Re-4低于G厂家，但就Re-5而言，Q厂家高抗体所占比例高于G厂家，且G厂家HI抗体效价没有达到11log2和12log2的。同时也能看出抗体L厂家的整齐度均高于其他两厂家。
34 从SPF鸡抗体消长规律可知， SPF鸡免疫后3周，免疫三家疫苗的HI抗体均≥796log2，4周即可达到高峰值，至25周时，仍维持在高抗体水平维持，Re-4抗体水平≥9log2， Re-5抗体水平≥779log2，同一家的疫苗Re-4抗体水平比Re-5抗体水平约高1个滴度。从总的趋势看，免疫L厂家疫苗的抗体水平高于其他两家，Q厂家和G厂家抗体水平相当。Re-4的抗体水平G厂家稍好于Q厂家，但Re-5的抗体水平Q厂家略高于G厂家（抗体消长规律试验仍在进行中）。
35 自2004年，我国政府对外公布了H5N1亚型高致病性禽流感病毒的疫情以来，规定对高致病性禽流感实行强制免疫，取得了一定的成效，但还存在各种各样的问题。长期以来，对招标禽流感疫苗的质量问题存在众多疑问。但从本试验对山东省35个批次的中标重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗（H5N1，Re-5株+Re-4株）质量检测结果显示，除1个批次疫苗外，免疫效果确实，免疫维持期较长，均达到或超过质量标准规定的要求。参 考 文 献：
[1] 甘孟侯禽流感（第2版）[M]北京：中国农业出版社， 2002
[2] 于康震 禽流感防控启示录[A]中国畜牧兽医学会禽病学分会第十四次学术研讨会论文集 [C]扬州：中国畜牧兽医学会禽病学分会编，2008
[3] 李明义，白志娟，宫 晓，等 禽流感H5亚型油乳剂灭活疫苗抗体消长规律的研究[J] 上海畜牧兽医通讯，2004，5：6-7 山 东 农 业 科 学 2012，44（12）：93～96，99