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摘 要：目的：探讨60 μmol/L槲皮素调节BRL大鼠肝细胞谷胱甘肽（GSH）代谢的可能机制。方法：采用MTT法测定槲皮素对BRL细胞活力的影响;采用试剂盒法检测细胞内GSH和GSSG的含量，以及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、肝脏谷胱甘肽 S转移酶（GST）、γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶（γ-GCL）、谷胱甘肽还原酶（GR）的活性;采用实时荧光定量PCR法检测GSH-Px、GST、γ-GCL和GR基因mRNA的表达情况;采用ELISA法测定细胞内的Keap1、总Nrf2、ERK1/2、磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）、JNK、p-JNK，以及细胞核Nrf2的蛋白水平。结果：槲皮素不影响大鼠肝细胞的活力（P>0.05）;与对照组比较，槲皮素组细胞内还原型GSH含量和GSH/GSSG比值（P<0.05）显著降低（P<0.05），γ-GCL酶活性显著减弱（P<0.05），GR和GSH-Px的mRNA表达显著减少（P<0.05），Keap1和JNK蛋白水平显著降低（P<0.05）。结论：槲皮素可减少BRL大鼠肝细胞还原型GSH的含量，这种作用主要与槲皮素抑制GSH的生成有关。
关键词：槲皮素;谷胱甘肽;γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶;Keap1/Nrf2信号通路;MAPKs信号通路
槲皮素是一种类黄酮物质，也是分布最广泛的多酚类化合物之一，主要存在于蔬菜、水果、红酒、茶叶等食物和饮料中[1]。我国绝大多数水果和蔬菜中均含有槲皮素，尤其是水果中的山楂、冬枣、红提、石榴等，以及蔬菜中的洋葱、茴香、菠菜、球茎甘蓝、小白菜等[2]。槲皮素对人体有许多有益的作用，如抗氧化、抗炎、免疫调节、抗2型糖尿病、预防动脉粥样硬化等[3-7]。本课题组前期的研究显示[8-9]，以含0.5%槲皮素的AIN93饲料饲喂大鼠，大鼠肝脏和血清中的谷胱甘肽（GSH）含量、还原型GSH与氧化型GSH（GSSG）比值显著降低;血清中的谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性增强;肝脏谷胱甘肽 S转移酶（GST）活性和mRNA表达显著增强，而谷氨酰半胱氨酸连接酶（GCL）活性和mRNA表达显著受抑，谷胱甘肽还原酶（GR）mRNA表达减少。本研究体外培养BRL正常大鼠肝细胞，以60μmol/L槲皮素诱导细胞内GSH含量减少，在此基础上探讨槲皮素对GSH代谢酶及相关代谢通路，如Kelch样红细胞衍生相关蛋白1（Keap1）/核因子E2样因子2（Nrf2）信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）信号通路的影响，为阐明槲皮素下调GSH含量的机制，以及制定槲皮素的推荐摄入量标准提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 细胞株与试剂
1.1.1 BRL细胞株 BRL 细胞株为正常大鼠肝细胞，购自中国科学院上海生命科学院。
1.1.2 试剂与试剂盒 槲皮素（纯度≥99.9%），美国Sigma-Aldrich公司;胎牛血清，美国Gibco Life Technologies;高糖DEME培养基，北京索莱宝科技有限公司;GSH、γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶（γ-GCL）、GR、GSH-Px、GST试剂盒，南京建成生物工程研究所;TRIzol试剂、cDNA合成試剂盒、SYBR Green Master mix，瑞士罗氏公司;Keap1、总Nrf2、核Nrf2、细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）、p-ERK1/2、c-Jun NH2-末端激酶（JNK）、p-JNK ELISA检测试剂盒，上海江莱生物科技有限公司;BCA蛋白试剂盒，上海生工生物工程股份有限公司。其余试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养及处理 将BRL细胞以4×105/mL的密度接种到含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，用60 μmol/L槲皮素干预4 h后，弃培养液后加1.25%胰酶消化细胞，1 000 r/min、5 min离心收集细胞沉淀。加入适量生理盐水后，用超声破碎仪（美国Sonics & Materials公司）破裂细胞，离心（4℃，10 000 r，20 min），取上清，用于GSH、γ-GCL、GR、GSH-Px、GST活性的测定。
1.2.2 细胞活力测定 槲皮素以DMSO溶解，制成浓缩液。实验时以完全培养液将其稀释，槲皮素在培养液中的终浓度为60 μmol/L，DMSO为0.5‰（v/v）。收集细胞沉淀，加完全培养基配制成细胞悬液，密度5×104/mL，将细胞悬液接种于96孔板，每孔200 μL。以MTT法测定60 μmol/L槲皮素干预4 h后细胞的活力，每组设5个复孔。参照冯建等[10]的方法进行。
1.2.3 GSH、γ-GCL、GR、GSH-Px、GST活性测定 按照南京建成生物工程研究所的试剂盒说明书进行。以uQuant 200-999超级酶标仪（美国Biotek公司）测定相应指标的吸光度值，按照公式计算GSH、GSSG的含量，以及4种酶的活性。
1.2.4 γ-GCL、GR、GSH-Px、GST mRNA表达测定 实时荧光定量PCR法（qPCR）。参照Zhang等[11]的方法进行。采用ABI实时定量PCR系统检测荧光信号，以GAPDH为内参，计算4种酶基因的相对表达量。所用的引物如表1所示。
1.2.5 Keap1、总Nrf2、核Nrf2、ERK1/2、磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）、JNK、p-JNK蛋白水平测定 按照上海江莱生物科技有限公司ELISA检测试剂盒说明书进行测定。绘制标准曲线，计算蛋白的表达量。
1.2.6 蛋白定量BCA法 按照上海生工生物工程股份有限公司的试剂盒操作进行测定，以uQuant 200-999超级酶标仪测定相应指标的吸光度值，按照公式计算细胞的蛋白含量。 [15]Dringen R.Metabolism and functions of glutathione in brain [J].Progress in Neurobiology，2000，62（6）：649-671.
[16]de Boer V C，et al.Tissue distribution of quercetin in rats and pigs [J].Journal of Nutrition，2005，135（7）：1718-1725.
[17]李素云，李崢，王立芹，等.槲皮素在Caco-2细胞中的代谢产物分析与初步鉴定 [J].国际药学研究杂志，2019，46（2）：123-129、136.
[18]李素云，李峥，王立芹，等.槲皮素在Caco-2单层细胞模型上的跨膜吸收和甲基化代谢[J].中国药理学与毒理学杂志，2019，33（4）：273-280.
[19]Manach C，et al.Quercetin is recovered in human plasma as conjugated derivatives which retain antioxidant properties [J].FEBS Lett，1998，426（3）：331-336.
[20]Yeh S L，Lin Y C，Lin Y L，et al.Comparing the metabolism of quercetin in rats，mice and gerbils [J].European Journal of Nutrition，2016，55（1）：413-422.
[21]O’Leary K A，Day A J，Needs P W，et al.Flavonoid glucuronides are substrates for human liver beta-glucuronidase [J].FEBS Lett，2001，503（1）：103-106.
[22]Nguyen T，Sherratt P J，Pickett C B.Regulatory mechanisms controlling gene expression mediated by the antioxidant response element [J].Annual Review of Pharmacology and Toxicology，2003（43）：233-260.
[23]Umemura K，Itoh T，Hamada N，et al.Preconditioning by sesquiterpene lactone enhances H2O2-induced Nrf2/ARE activation [J].Biochemical and Biophysical Research Communications，2008，368（4）：948-954.
[24]Sekhar K R，Rachakonda G，Freeman M L.Cysteine-based regulation of the CUL3 adaptor protein Keap1 [J].Toxicology and Applied Pharmacology，2010，244（1）：21-26.
[25]Owens D M，Keyse S M.Differential regulation of MAP kinase signalling by dual-specificity protein phosphatases [J].Oncogene，2007，26（22）：3203-3213.
[26]Zhang Y，Dong C.Regulatory mechanisms of mitogen-activated kinase signaling [J].Cellular and molecular life sciences，2007，64（21）：2771-2789.
[27]Jiménez-Castro M B，et al.Mitogen activated protein kinases in steatotic and non-steatotic livers submitted to ischemia-reperfusion [J].International Journal of Molecular Sciences，2019，20（7）：1785.
[28]Min K，Ebeler S E.Quercetin inhibits hydrogen peroxide-induced DNA damage and enhances DNA repair in Caco-2 cells [J].Food and Chemical Toxicology，2009，47（11）：2716-2722.
[29]Daubney J，et al. Cardioprotective and cardiotoxic effects of quercetin and two of its in vivo metabolites on differentiated h9c2 cardiomyocytes [J].Basic and Clinical Pharmacology Toxicology，2015，116（2）：96-109.
Mechanism of Quercetin on Modulating Glutathione Metabolism in Rat Hepatocytes
GAO Wei-na，BIAN Xiang-yu，JIN Xiu，WANG Ling-ling，MA Yu-ying，YU Yi-jing，PU Ling-ling*，GUO Chang-jiang* （Tianjin Institute of Environmental and Operational Medicine，Academy of Military Medical Sciences，Academy of Military Sciences，Tianjin 300050，China）
Abstract：【Objective】 To explore possible mechanisms of quercetin（60 μmol/L）on glutathione（GSH）metabolism in BRL rat hepatocytes.【Method】 The viability of hepatocytes was measure by MTT method.Intracellular GSH and GSSG contents，as well as activities of glutathione peroxidase（GSH-Px），glutathione s-transferase（GST），γ-glutamic cysteine ligase（γ-GCL）and glutathione reductase（GR）were measured by commercial kits.Message RNA expressions of GSH-Px，GST，γ-GCL and GR genes were assayed by quantitative real-time PCR method.Protein levels of Keap1，total Nrf2，ERK1/2，phosphorylated ERK（p-ERK1/2），JNK，p-JNK，and nuclear Nrf2 were determined by ELISA method.Protein quantification was assayed by BCA method.【Result】 Quercetin had no effect on viability of rat hepatocytes（P>0.05）.Compared with control，intracelluar GSH content and GSH/GSSG ratio were decreased distinctly（P<0.05），activity of γ-GCL was weakened notably（P<0.05），mRNA expression of GR and GSH-Px was reduced remarkably（P<0.05），and protein levels of Keap1 and JNK were decreased significantly in quercetin group（P<0.05）.【Conclusion】 Quercetin reduces the content of reduced GSH in BRL rat hepatocytes，which was mainly due to the inhibition of GSH production.
Keywords：quercetin;glutathione（GSH）;γ-glutamic cysteine ligase（γ-GCL）;Keap1/Nrf2 signal transduction pathway;MAPKs signal transduction pathway
基金項目：国家自然科学基金面上项目（项目编号：81372988）。
作者简介：高蔚娜（1977— ），女，博士，副研究员，研究方向：植物化学物的生物学活性。
共同通信作者：蒲玲玲（1979— ），女，硕士，高级实验师，研究方向：植物化学物的生物学功能;郭长江（1963— ），男，博士，研究员，研究方向：植物化学物的生物学活性。
关键词：槲皮素;谷胱甘肽;γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶;Keap1/Nrf2信号通路;MAPKs信号通路
槲皮素是一种类黄酮物质，也是分布最广泛的多酚类化合物之一，主要存在于蔬菜、水果、红酒、茶叶等食物和饮料中[1]。我国绝大多数水果和蔬菜中均含有槲皮素，尤其是水果中的山楂、冬枣、红提、石榴等，以及蔬菜中的洋葱、茴香、菠菜、球茎甘蓝、小白菜等[2]。槲皮素对人体有许多有益的作用，如抗氧化、抗炎、免疫调节、抗2型糖尿病、预防动脉粥样硬化等[3-7]。本课题组前期的研究显示[8-9]，以含0.5%槲皮素的AIN93饲料饲喂大鼠，大鼠肝脏和血清中的谷胱甘肽（GSH）含量、还原型GSH与氧化型GSH（GSSG）比值显著降低;血清中的谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性增强;肝脏谷胱甘肽 S转移酶（GST）活性和mRNA表达显著增强，而谷氨酰半胱氨酸连接酶（GCL）活性和mRNA表达显著受抑，谷胱甘肽还原酶（GR）mRNA表达减少。本研究体外培养BRL正常大鼠肝细胞，以60μmol/L槲皮素诱导细胞内GSH含量减少，在此基础上探讨槲皮素对GSH代谢酶及相关代谢通路，如Kelch样红细胞衍生相关蛋白1（Keap1）/核因子E2样因子2（Nrf2）信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）信号通路的影响，为阐明槲皮素下调GSH含量的机制，以及制定槲皮素的推荐摄入量标准提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 细胞株与试剂
1.1.1 BRL细胞株 BRL 细胞株为正常大鼠肝细胞，购自中国科学院上海生命科学院。
1.1.2 试剂与试剂盒 槲皮素（纯度≥99.9%），美国Sigma-Aldrich公司;胎牛血清，美国Gibco Life Technologies;高糖DEME培养基，北京索莱宝科技有限公司;GSH、γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶（γ-GCL）、GR、GSH-Px、GST试剂盒，南京建成生物工程研究所;TRIzol试剂、cDNA合成試剂盒、SYBR Green Master mix，瑞士罗氏公司;Keap1、总Nrf2、核Nrf2、细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）、p-ERK1/2、c-Jun NH2-末端激酶（JNK）、p-JNK ELISA检测试剂盒，上海江莱生物科技有限公司;BCA蛋白试剂盒，上海生工生物工程股份有限公司。其余试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养及处理 将BRL细胞以4×105/mL的密度接种到含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，用60 μmol/L槲皮素干预4 h后，弃培养液后加1.25%胰酶消化细胞，1 000 r/min、5 min离心收集细胞沉淀。加入适量生理盐水后，用超声破碎仪（美国Sonics & Materials公司）破裂细胞，离心（4℃，10 000 r，20 min），取上清，用于GSH、γ-GCL、GR、GSH-Px、GST活性的测定。
1.2.2 细胞活力测定 槲皮素以DMSO溶解，制成浓缩液。实验时以完全培养液将其稀释，槲皮素在培养液中的终浓度为60 μmol/L，DMSO为0.5‰（v/v）。收集细胞沉淀，加完全培养基配制成细胞悬液，密度5×104/mL，将细胞悬液接种于96孔板，每孔200 μL。以MTT法测定60 μmol/L槲皮素干预4 h后细胞的活力，每组设5个复孔。参照冯建等[10]的方法进行。
1.2.3 GSH、γ-GCL、GR、GSH-Px、GST活性测定 按照南京建成生物工程研究所的试剂盒说明书进行。以uQuant 200-999超级酶标仪（美国Biotek公司）测定相应指标的吸光度值，按照公式计算GSH、GSSG的含量，以及4种酶的活性。
1.2.4 γ-GCL、GR、GSH-Px、GST mRNA表达测定 实时荧光定量PCR法（qPCR）。参照Zhang等[11]的方法进行。采用ABI实时定量PCR系统检测荧光信号，以GAPDH为内参，计算4种酶基因的相对表达量。所用的引物如表1所示。
1.2.5 Keap1、总Nrf2、核Nrf2、ERK1/2、磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）、JNK、p-JNK蛋白水平测定 按照上海江莱生物科技有限公司ELISA检测试剂盒说明书进行测定。绘制标准曲线，计算蛋白的表达量。
1.2.6 蛋白定量BCA法 按照上海生工生物工程股份有限公司的试剂盒操作进行测定，以uQuant 200-999超级酶标仪测定相应指标的吸光度值，按照公式计算细胞的蛋白含量。 [15]Dringen R.Metabolism and functions of glutathione in brain [J].Progress in Neurobiology，2000，62（6）：649-671.
[16]de Boer V C，et al.Tissue distribution of quercetin in rats and pigs [J].Journal of Nutrition，2005，135（7）：1718-1725.
[17]李素云，李崢，王立芹，等.槲皮素在Caco-2细胞中的代谢产物分析与初步鉴定 [J].国际药学研究杂志，2019，46（2）：123-129、136.
[18]李素云，李峥，王立芹，等.槲皮素在Caco-2单层细胞模型上的跨膜吸收和甲基化代谢[J].中国药理学与毒理学杂志，2019，33（4）：273-280.
[19]Manach C，et al.Quercetin is recovered in human plasma as conjugated derivatives which retain antioxidant properties [J].FEBS Lett，1998，426（3）：331-336.
[20]Yeh S L，Lin Y C，Lin Y L，et al.Comparing the metabolism of quercetin in rats，mice and gerbils [J].European Journal of Nutrition，2016，55（1）：413-422.
[21]O’Leary K A，Day A J，Needs P W，et al.Flavonoid glucuronides are substrates for human liver beta-glucuronidase [J].FEBS Lett，2001，503（1）：103-106.
[22]Nguyen T，Sherratt P J，Pickett C B.Regulatory mechanisms controlling gene expression mediated by the antioxidant response element [J].Annual Review of Pharmacology and Toxicology，2003（43）：233-260.
[23]Umemura K，Itoh T，Hamada N，et al.Preconditioning by sesquiterpene lactone enhances H2O2-induced Nrf2/ARE activation [J].Biochemical and Biophysical Research Communications，2008，368（4）：948-954.
[24]Sekhar K R，Rachakonda G，Freeman M L.Cysteine-based regulation of the CUL3 adaptor protein Keap1 [J].Toxicology and Applied Pharmacology，2010，244（1）：21-26.
[25]Owens D M，Keyse S M.Differential regulation of MAP kinase signalling by dual-specificity protein phosphatases [J].Oncogene，2007，26（22）：3203-3213.
[26]Zhang Y，Dong C.Regulatory mechanisms of mitogen-activated kinase signaling [J].Cellular and molecular life sciences，2007，64（21）：2771-2789.
[27]Jiménez-Castro M B，et al.Mitogen activated protein kinases in steatotic and non-steatotic livers submitted to ischemia-reperfusion [J].International Journal of Molecular Sciences，2019，20（7）：1785.
[28]Min K，Ebeler S E.Quercetin inhibits hydrogen peroxide-induced DNA damage and enhances DNA repair in Caco-2 cells [J].Food and Chemical Toxicology，2009，47（11）：2716-2722.
[29]Daubney J，et al. Cardioprotective and cardiotoxic effects of quercetin and two of its in vivo metabolites on differentiated h9c2 cardiomyocytes [J].Basic and Clinical Pharmacology Toxicology，2015，116（2）：96-109.
Mechanism of Quercetin on Modulating Glutathione Metabolism in Rat Hepatocytes
GAO Wei-na，BIAN Xiang-yu，JIN Xiu，WANG Ling-ling，MA Yu-ying，YU Yi-jing，PU Ling-ling*，GUO Chang-jiang* （Tianjin Institute of Environmental and Operational Medicine，Academy of Military Medical Sciences，Academy of Military Sciences，Tianjin 300050，China）
Abstract：【Objective】 To explore possible mechanisms of quercetin（60 μmol/L）on glutathione（GSH）metabolism in BRL rat hepatocytes.【Method】 The viability of hepatocytes was measure by MTT method.Intracellular GSH and GSSG contents，as well as activities of glutathione peroxidase（GSH-Px），glutathione s-transferase（GST），γ-glutamic cysteine ligase（γ-GCL）and glutathione reductase（GR）were measured by commercial kits.Message RNA expressions of GSH-Px，GST，γ-GCL and GR genes were assayed by quantitative real-time PCR method.Protein levels of Keap1，total Nrf2，ERK1/2，phosphorylated ERK（p-ERK1/2），JNK，p-JNK，and nuclear Nrf2 were determined by ELISA method.Protein quantification was assayed by BCA method.【Result】 Quercetin had no effect on viability of rat hepatocytes（P>0.05）.Compared with control，intracelluar GSH content and GSH/GSSG ratio were decreased distinctly（P<0.05），activity of γ-GCL was weakened notably（P<0.05），mRNA expression of GR and GSH-Px was reduced remarkably（P<0.05），and protein levels of Keap1 and JNK were decreased significantly in quercetin group（P<0.05）.【Conclusion】 Quercetin reduces the content of reduced GSH in BRL rat hepatocytes，which was mainly due to the inhibition of GSH production.
Keywords：quercetin;glutathione（GSH）;γ-glutamic cysteine ligase（γ-GCL）;Keap1/Nrf2 signal transduction pathway;MAPKs signal transduction pathway
基金項目：国家自然科学基金面上项目（项目编号：81372988）。
作者简介：高蔚娜（1977— ），女，博士，副研究员，研究方向：植物化学物的生物学活性。
共同通信作者：蒲玲玲（1979— ），女，硕士，高级实验师，研究方向：植物化学物的生物学功能;郭长江（1963— ），男，博士，研究员，研究方向：植物化学物的生物学活性。