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【摘要】：本方法利用葡萄糖氧化酶能催化氧化葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢在辣根过氧化物酶的作用下氧化邻联茴香胺生成水和红色产物，通过测定产物吸光度变化速率用分光光度法定量计算出葡萄糖氧化酶活力。经研究在酶浓度为0.1～0.5GODU/mL，缓冲液pH为6.0，水浴温度为30℃的条件下，该方法具有有良好的重现性和稳定性。
【关键字】：葡萄糖氧化酶活力；邻联茴香胺；分光光度法。
1 引言
葡萄糖氧化酶是一种绿色饲料添加剂，在饲料和畜牧生产中可作为抗氧化剂减缓饲料氧化变质[1]，改善动物肠道微生物平衡[2]，提高饲料利用率[3]，促进动物生长，降低中毒反应更在一定程度上替代抗菌药物和抗球虫病药物，具有广泛的应用前景。
由于葡萄糖氧化酶的高度专一性，基于不同的酶活定义而建立的检测方法主要有电化学法、测压法、凝胶电泳法、滴定法、分光光度法和傅立叶变换红外光谱法等[4]。电化学法、测压法、凝胶电泳法存在方法操作复杂，要求严格，有很强的仪器依赖性；滴定法存在工作量大、样品需要量大、人工读数导致的测量精度低，尤其在混合型饲料添加剂的检测中不能排除酸性、碱性载体干扰的缺点。傅立叶变换红外光谱法是较新开发的一种检测方法，优点为检测速度快，试剂用量少。缺点为仪器要求和模型建立需要前期投入太大，限制了其使用范围。因此寻找一种简便，快捷，灵敏的高的酶活力检测方法很有意义。
本研究采用邻联茴香胺分光光度法测定葡糖糖酶活力。反应机理为：葡萄糖氧化酶是一种需氧脱氢酶，能催化氧化葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢和无色的还原型邻联茴香胺在过氧化物酶的作用下生成水和红色的氧化型邻联茴香胺。在一定的pH、温度、浓度及反应时间内通过测定产物吸光度在460nm波长下的变化速率定量计算出酶活力。基本反应式为：
β-D-葡萄糖+H20+O2 δ-D-葡萄糖基-1，5-内酯+H2O
H2O2+邻联茴香胺 氧化型邻联茴香胺+2H2O
1实验部分
1.1仪器设备
北京瑞利仪器有限公司UV-2600型紫外可见分光光度计；北京中兴伟业仪器有限公司DZKW-2型电热恒温水浴锅；赛多利斯科学仪器有限公司BSA224S型分析天平。
1.2实验试剂和材料
标示含量为40GODU/g的葡萄糖氧化酶饲料添加剂；辣根过氧化物酶（上海蓝季生物）；邻联茴香胺（sigma，D9143）；磷酸二氢钠（国药试剂）；磷酸氢二钠（国药试剂）；葡萄糖（国药试剂）。
1.3溶液与配制方法
1.3.1磷酸盐缓冲液（pH=6.0）：称取16.61g磷酸二氢钠和35.82g磷酸氢二钠溶于无二氧化碳水中，稀释到1000mL。
1.3.2邻联茴香胺甲醇溶液：称取1g邻联茴香胺加在100mL甲醇中搅拌溶解备用。临用现配。使用时取0.1mL加到上述缓冲液12mL中混匀。
1.3.3 葡萄糖水溶液（180g/L）：称取18g葡萄糖加在100mL蒸馏水中搅拌溶解。
1.3.4辣根过氧化物酶溶液（0.5mg/mL）：称取50mg辣根过氧化物酶，用10mL水溶解。
1.4测定方法
称样品1.000g置于500mL容量瓶中，加入蒸馏水稀释，搅拌均匀后，定容至刻度。用快速滤纸过滤，滤液作为样品溶液（必要时稀释样品溶液），取两只洁净试管。分别加入邻联茴香胺甲醇缓冲液5ml，葡萄糖溶液0.6mL，辣根过氧化物酶溶液0.2mL，置于30℃恒温水浴中，恒温后向其中一管中加入0.2mL蒸馏水，作为空白对照在460nm波长处调零。向样品管中加入0.2mL样品溶液摇匀，立即在460nm波长处用1cm比色皿在紫外分光光度计中读取吸光度值，以后每隔1min测定其吸光度，连续测定5min。利用该方法测定时，酶活单位为：在pH=6.0，温度30℃条件下，每分钟催化氧化1μmoLβ-D-葡萄糖转化为葡萄糖酸和过氧化氢的量为一个酶活单位用GODU表示。
1.5结果计算
酶活力
式中，△A460：一定時间内460nm处吸光值变化；△t：吸光值变化对应的反应时间，单位为min；11.3：消光系数；V1：样品定容体积，单位为mL；V2：反应体系体积，6mL；m：样品称样量，单位为g；V3：移取酶液的体积，0.2mL；n：稀释倍数。
2结果与讨论
2.1酶液浓度范围讨论
将待测酶液稀释分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5GODU/mL依据本实验2.3实验条件，分别测定1～4min内平均吸光度变化值△A/△t。并以吸光度变化速率为纵坐标，以酶液浓度为横坐标作图，如图1所示。
从图1可以看出在酶液浓度为0.1～0.5GODU/mL的范围内，吸光度变化速率稳定且线性关系良好，相关系数R≥0.999。
2.2缓冲溶液pH值对酶活测定影响的讨论
缓冲溶液pH值在3.0～7.0之间变化，其余条件依据本实验2.3要求进行测定，研究缓冲溶液pH值对葡萄糖氧化酶活力测定的影响，如图2所示。
从图2可以看出，在本实验的缓冲溶液pH值变化范围内，pH值对结果的影响较为显著。在pH为6.0时葡萄糖氧化酶活力最大。因此，本方法测定葡萄糖氧化酶活力时采用pH=6.0的磷酸盐缓冲液进行测定。
2.3反应温度对酶活力测定影响的讨论
反应温度在25～60℃之间变化，其余条件依据本实验2.3要求进行测定，研究反应温度对葡萄糖氧化酶活力测定的影响，如图3所示。
从图3可以看出，在本实验的反应温度变化范围内，在反应温度为30℃时葡萄糖氧化酶活力最大。因此，本方法测定葡萄糖氧化酶活力时采用30℃作为最佳反应温度。
2.4反应时间的选择
依据本实验2.3要求测定浓度分别为浓度为0.2GODU/mL的酶液，连续测定三次，每次连续测定6min ，分别记录每分钟吸光度，结果见表1。
表1中可以看出，在反应的第1min内，反应速度最快且不稳定。当反应时间在1～4min内反应较为稳定，当反应时间到第5min以后反应速率明显减慢。因此，本方法采用反应时间为第1min与第4min吸光度差作为两点法[5]的计算数据，进行计算葡糖糖氧化酶酶活力。
结论
综上所述，采用邻联茴香胺分光光度法测定饲料添加剂中葡萄糖氧化酶活力时，在酶液浓度为0.1～0.5GODU/mL，缓冲液pH为6.0，反应温度为30℃，选取第4min与第1min的吸光度差依据两点法计算。该方法操作简便，反应迅速，精密度高，反应系统较为稳定。
【参考文献】：
[1] 杨久仙，曹靖.葡萄糖氧化酶的应用进展，山西农业大学学报（自然科学版）[J]，2013，33（1）：88-92.
[2] 宋海彬等.葡萄糖氧化酶制剂对肉鸡肠道形态结构和消化酶活性的影响，中国畜牧杂志[J]，2010.46（23）：56-59.
[3] 樊霞，肖志明等饲料添加剂葡萄糖氧化酶检测方法研究进展，农产品质量与安全[J]，2014（6）：21-30.
[4] 熊云霞等.葡糖糖氧化酶在畜牧业中的应用及检测方法研究进展，饲料工业杂质[J]，2016.37（4）：15-20.
[5] 李丕武，刘瑜，李瑞瑞等，两种葡萄糖氧化酶测定方法的比较，食品工业科技[J]，2013.（12）：71-74.
【关键字】：葡萄糖氧化酶活力；邻联茴香胺；分光光度法。
1 引言
葡萄糖氧化酶是一种绿色饲料添加剂，在饲料和畜牧生产中可作为抗氧化剂减缓饲料氧化变质[1]，改善动物肠道微生物平衡[2]，提高饲料利用率[3]，促进动物生长，降低中毒反应更在一定程度上替代抗菌药物和抗球虫病药物，具有广泛的应用前景。
由于葡萄糖氧化酶的高度专一性，基于不同的酶活定义而建立的检测方法主要有电化学法、测压法、凝胶电泳法、滴定法、分光光度法和傅立叶变换红外光谱法等[4]。电化学法、测压法、凝胶电泳法存在方法操作复杂，要求严格，有很强的仪器依赖性；滴定法存在工作量大、样品需要量大、人工读数导致的测量精度低，尤其在混合型饲料添加剂的检测中不能排除酸性、碱性载体干扰的缺点。傅立叶变换红外光谱法是较新开发的一种检测方法，优点为检测速度快，试剂用量少。缺点为仪器要求和模型建立需要前期投入太大，限制了其使用范围。因此寻找一种简便，快捷，灵敏的高的酶活力检测方法很有意义。
本研究采用邻联茴香胺分光光度法测定葡糖糖酶活力。反应机理为：葡萄糖氧化酶是一种需氧脱氢酶，能催化氧化葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢和无色的还原型邻联茴香胺在过氧化物酶的作用下生成水和红色的氧化型邻联茴香胺。在一定的pH、温度、浓度及反应时间内通过测定产物吸光度在460nm波长下的变化速率定量计算出酶活力。基本反应式为：
β-D-葡萄糖+H20+O2 δ-D-葡萄糖基-1，5-内酯+H2O
H2O2+邻联茴香胺 氧化型邻联茴香胺+2H2O
1实验部分
1.1仪器设备
北京瑞利仪器有限公司UV-2600型紫外可见分光光度计；北京中兴伟业仪器有限公司DZKW-2型电热恒温水浴锅；赛多利斯科学仪器有限公司BSA224S型分析天平。
1.2实验试剂和材料
标示含量为40GODU/g的葡萄糖氧化酶饲料添加剂；辣根过氧化物酶（上海蓝季生物）；邻联茴香胺（sigma，D9143）；磷酸二氢钠（国药试剂）；磷酸氢二钠（国药试剂）；葡萄糖（国药试剂）。
1.3溶液与配制方法
1.3.1磷酸盐缓冲液（pH=6.0）：称取16.61g磷酸二氢钠和35.82g磷酸氢二钠溶于无二氧化碳水中，稀释到1000mL。
1.3.2邻联茴香胺甲醇溶液：称取1g邻联茴香胺加在100mL甲醇中搅拌溶解备用。临用现配。使用时取0.1mL加到上述缓冲液12mL中混匀。
1.3.3 葡萄糖水溶液（180g/L）：称取18g葡萄糖加在100mL蒸馏水中搅拌溶解。
1.3.4辣根过氧化物酶溶液（0.5mg/mL）：称取50mg辣根过氧化物酶，用10mL水溶解。
1.4测定方法
称样品1.000g置于500mL容量瓶中，加入蒸馏水稀释，搅拌均匀后，定容至刻度。用快速滤纸过滤，滤液作为样品溶液（必要时稀释样品溶液），取两只洁净试管。分别加入邻联茴香胺甲醇缓冲液5ml，葡萄糖溶液0.6mL，辣根过氧化物酶溶液0.2mL，置于30℃恒温水浴中，恒温后向其中一管中加入0.2mL蒸馏水，作为空白对照在460nm波长处调零。向样品管中加入0.2mL样品溶液摇匀，立即在460nm波长处用1cm比色皿在紫外分光光度计中读取吸光度值，以后每隔1min测定其吸光度，连续测定5min。利用该方法测定时，酶活单位为：在pH=6.0，温度30℃条件下，每分钟催化氧化1μmoLβ-D-葡萄糖转化为葡萄糖酸和过氧化氢的量为一个酶活单位用GODU表示。
1.5结果计算
酶活力
式中，△A460：一定時间内460nm处吸光值变化；△t：吸光值变化对应的反应时间，单位为min；11.3：消光系数；V1：样品定容体积，单位为mL；V2：反应体系体积，6mL；m：样品称样量，单位为g；V3：移取酶液的体积，0.2mL；n：稀释倍数。
2结果与讨论
2.1酶液浓度范围讨论
将待测酶液稀释分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5GODU/mL依据本实验2.3实验条件，分别测定1～4min内平均吸光度变化值△A/△t。并以吸光度变化速率为纵坐标，以酶液浓度为横坐标作图，如图1所示。
从图1可以看出在酶液浓度为0.1～0.5GODU/mL的范围内，吸光度变化速率稳定且线性关系良好，相关系数R≥0.999。
2.2缓冲溶液pH值对酶活测定影响的讨论
缓冲溶液pH值在3.0～7.0之间变化，其余条件依据本实验2.3要求进行测定，研究缓冲溶液pH值对葡萄糖氧化酶活力测定的影响，如图2所示。
从图2可以看出，在本实验的缓冲溶液pH值变化范围内，pH值对结果的影响较为显著。在pH为6.0时葡萄糖氧化酶活力最大。因此，本方法测定葡萄糖氧化酶活力时采用pH=6.0的磷酸盐缓冲液进行测定。
2.3反应温度对酶活力测定影响的讨论
反应温度在25～60℃之间变化，其余条件依据本实验2.3要求进行测定，研究反应温度对葡萄糖氧化酶活力测定的影响，如图3所示。
从图3可以看出，在本实验的反应温度变化范围内，在反应温度为30℃时葡萄糖氧化酶活力最大。因此，本方法测定葡萄糖氧化酶活力时采用30℃作为最佳反应温度。
2.4反应时间的选择
依据本实验2.3要求测定浓度分别为浓度为0.2GODU/mL的酶液，连续测定三次，每次连续测定6min ，分别记录每分钟吸光度，结果见表1。
表1中可以看出，在反应的第1min内，反应速度最快且不稳定。当反应时间在1～4min内反应较为稳定，当反应时间到第5min以后反应速率明显减慢。因此，本方法采用反应时间为第1min与第4min吸光度差作为两点法[5]的计算数据，进行计算葡糖糖氧化酶酶活力。
结论
综上所述，采用邻联茴香胺分光光度法测定饲料添加剂中葡萄糖氧化酶活力时，在酶液浓度为0.1～0.5GODU/mL，缓冲液pH为6.0，反应温度为30℃，选取第4min与第1min的吸光度差依据两点法计算。该方法操作简便，反应迅速，精密度高，反应系统较为稳定。
【参考文献】：
[1] 杨久仙，曹靖.葡萄糖氧化酶的应用进展，山西农业大学学报（自然科学版）[J]，2013，33（1）：88-92.
[2] 宋海彬等.葡萄糖氧化酶制剂对肉鸡肠道形态结构和消化酶活性的影响，中国畜牧杂志[J]，2010.46（23）：56-59.
[3] 樊霞，肖志明等饲料添加剂葡萄糖氧化酶检测方法研究进展，农产品质量与安全[J]，2014（6）：21-30.
[4] 熊云霞等.葡糖糖氧化酶在畜牧业中的应用及检测方法研究进展，饲料工业杂质[J]，2016.37（4）：15-20.
[5] 李丕武，刘瑜，李瑞瑞等，两种葡萄糖氧化酶测定方法的比较，食品工业科技[J]，2013.（12）：71-74.