【摘 要】
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以-35℃低温冷冻保存3个月的Vari-Fe-8mos和Fahru-Fe-9mos死亡牛胎儿皮肤上皮细胞,为核供体细胞,应用点击去核方法,和-300mmHg、2%CO2、8%～10%O2、38.5℃和100%湿度负压气相培
【机 构】
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山东莱阳农学院动物胚胎工程中心,山口大学农学部连合兽医学研究科
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以-35℃低温冷冻保存3个月的Vari-Fe-8mos和Fahru-Fe-9mos死亡牛胎儿皮肤上皮细胞,为核供体细胞,应用点击去核方法,和-300mmHg、2%CO2、8%～10%O2、38.5℃和100%湿度负压气相培养系统(负压组),进行了克隆牛试验研究,并与吸引和挤压及常压培养法进行了比较.结果表明,采用点击去核法对体外成熟培养18h、22h、24h的卵母细胞进行去核,去核成功率分别为90.0%、75.8%和55.6%,18h组显著高于22h组(P＜0.05),极显著高于24h组(P＜0.01);而且,点击去核法去核率为90.0%,极显著地高于吸引法的68.3%(P＜0.01),与挤压法去核率88.3%差异不显著;采用点击去核法囊胚发育率达34.1%,显著高于吸引法的18.0%(P＜0.05),与挤压法的20.9%差异不显著.负压组重构胚的卵裂率达70.0%,显著高于常压组的63.8%(P＜0.05),负压组囊胚发育率达35.8%,极显著高于常压组的23.2%(P＜0.01),负压组克隆囊胚细胞数为108±3.3个,极显著多于常压组的98±3.3(P＜0.01.将第6天的克隆桑椹胚和囊胚每2～3枚装入1支0.25ml塑料细管中,移植给同期发情处理的5头受体奶牛的黄体侧子宫角中,最终获得2头牛妊娠,并于2001年11月3日和11月6日产2头黑色雌性肉牛"康康"和"双双".通过微卫星DNA标记确认,克隆牛"康康"为来源于Vari-Fe-8mos牛胎儿皮肤上皮细胞,"双双"来源于Fahru-Fe-9mos牛胎儿皮肤上皮细胞的后代.试验结果表明,本研究所采用以-35℃低温冷冻保存3个月的牛胎儿皮肤细胞为核供体细胞,应用点击去核方法和负压气相培养系统制备克隆牛,具有一定的先进性和实用性.
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