【目的】筛选钩丝孢属真菌高产蛋白酶菌株，并优化其产酶培养基和发酵条件，为寄生线虫病的生物防治提供优良菌种。【方法】以15株钩丝孢属真菌为材料，在28 ℃、180 r/min振荡培养10 d后，采用福林酚法测定其蛋白酶活性，筛选高产蛋白酶菌株，测定其产酶周期，并利用全齿复活线虫测定该菌株发酵液的杀线虫率。通过单因素试验和正交试验对高产蛋白酶菌株的产酶培养基及发酵条件进行优化，并对优化条件进行验证。【结果】从15株钩丝孢属真菌中筛选出1株高产蛋白酶菌株H6，其蛋白酶活性在发酵5 d最高。最佳产酶培养基成分为葡萄糖8 g/L、明胶8 g/L、蛋白胨8 g/L、酵母提取物4 g/L。最佳发酵条件为pH 7.0、20 ℃、260 r/min、接种2块直径5 mm的菌块。在此优化条件下，菌株H6蛋白酶活性为216.42 U/mL，比优化前（67.84 U/mL）提高了2.19倍。【结论】筛选出1株钩丝孢属高产蛋白酶菌株H6，获得了其优化产酶培养基和发酵条件。