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【摘 要】目的：本研究的目的是探討PCR技术联合常规方法在肺外结核疾病中的诊断效果。材料和方法：所有标本均采集于在临床上疑似肺外结核的病例。我们利用齐尼氏痰涂片检查（ZNS），改良罗氏培养法（LJM）和PCR技术对匀浆标本进行检测。结果：总共有182例疑似为肺外结核的标本节接受了上述三种方法的检查。其中22例经至少一种方法检测证实为阳性。PCR技术检测出肺外结核病例最多，其次是细菌培养。结论：联合使用现有的检测技术可以提高实验室对存在于临床标本中的结核分枝杆菌的检出率。而PCR技术必须包含在肺外结核的诊断程序之中。
【关键词】肺外结核；PCR 金标准
【文章编号】1004-7484（2014）06-3508-02
结核病是一项重大的公共健康问题。每年，世界范围内新增确诊病例超过900万，而登记在册的死亡病例将近200万[1]。肺外结核占所有免疫功能不全并罹患结核的病人总数的1/5。在HIV阳性个体中，肺外结核发病率非常高，占全部结核病例的50%[2]。由于此病对于标准的抗结核菌疗法比较敏感，所以早期精确的诊断至关重要。分子生物学方法是诊断肺外结核较好的一个选择，PCR技术具有较高的敏感性，特异性和诊断速度[3]。
1 材料和方法：
收集承德医学院附属医院2008年至2013年对193例疑似肺外结核的临床标本的检测结果。193例标本均进行PCR检测，其中11标本由于量比较小，而未进行常规方法检测。对剩余182例标本进行PCR检测和常规方法检测的对照分析。
首先将这些收集的标本进行匀浆化处理。然后对匀浆化的标本进行齐尼氏痰涂片，改良罗氏法培养和PCR技术检测。使用QIAampDNA微型试剂盒对DNA进行提取。
我们利用两种PCR体外诊断试剂盒【Real-TM（Sacace）J检测试剂盒以IS6110为靶序列设计引物，Seeplex多重分子检测诊断试剂盒（Seegene）以IS6110和MPB64为靶序列设计引物】对标本进行检测。所有接受PCR检测的标本均进行齐尼氏痰涂片检查以及改良罗氏法的细菌培养。我们对培养物进行了为8周的观察。
统计学分析：我们利用Kappa检验确定本研究中不同的检测方法的结果是否一致。利用卡方检验对于数据进行分析。统计学软件为SPSS20。
2 结果：在所有被检测的标本中肺外结核总阳性率为12.1%（表一）。其中PCR检测阳性为20例。结核菌培养阳性为9例，痰涂片法为6例。其中，经三种方法检测，仅PCR技术显示为阳性的标本为10例。而PCR检测为阴性，而常规方法检测为阳性的标本为2例。仅3例标本，三种检测方法结果均显示为阳性。PCR检测的阳性率在脓液标本中最高（表二）。
由于细菌培养在诊断结核并不是一项理想的金标准，我们应用Kappa检验来评价细菌培养和PCR技术检测结果的一致性水平。结果显示，两种方法的检测结果具有中等水平的一致性，Kappa值为0.59。
和痰涂片这种常规快速的检测方法相比，由PCR技术检测出来肺外结核阳性例数明显增多，具有统计学差异。同样，PCR检测出来的阳性病例也明显多于细菌培养的结果。PCR技术和两种方法联合检测的结果进行对照也具有统计学意义。
3 讨论：
在本研究中，182例疑似为肺外结核的病例标本，经不同的方法检测最终有22例得到确诊。本研究中， 细菌培养检测出的阳性率为3.3%。虽然细菌培养是诊断结核病的金标准，但是其缺乏敏感性、特异性和速度，尤其是在肺外结核的检测方面。
PCR诊断技术的特异性非常高，而关于敏感性的报道却并不一样。我们认为，只要运用合理，PCR技术在诊断肺外结核疾病方面具有非常高的敏感性[8]。本研究中，PCR技术在全部受检标本中检测出结核分枝杆菌的比例为11%。相关报道PCR技术在非呼吸系统标本检出结核杆菌的阳性率为8.6%-63%[9-11]。在本研究，经实验室诊断证实的病例中，由PCR技术检出的占90.9%，比例最高。而常规方法检测总共占到全部病例的54.6%。所有LJM检测为阳性的病例，也由PCR技术证实为阳性。
本研究显示，PCR技术是一项非常有效迅速的检测方法。将PCR技术和培养的检测结果进行对照分析，二者具有显著的统计学差异。而单独应用PCR技术和联合两种常规方法检测的结果之间对照发现，同样具有显著的统计学差异。在在我们的研究中，结核杆菌培养和PCR检测技术存在中等水平的一致性（k=0.59）。PCR技术和结核杆菌培养的结果并非完全一致。可能是由于PCR技术比常规方法的检测诊断效果更好。本研究显示，和其他诊断技术相比，PCR是诊断肺外结核最好的方法。
PCR技术对两例标本检测结果为阴性，而通过常规方法检测为阳性。我们排除了标本中存在PCR抑制剂的可能性，而其阴性的结果可能是由于IS6110插入序列片段复制物含量比较低的原因。目前为止，PCR技术的敏感性和结核病的诊断方面的相关理论还处于探索之中。WHO和其他健康机构现今仍然推荐结核菌培养作为诊断的金标准。
PCR技术在许多情况下已经成为了一项常规诊疗程序。因为其对标本的结核分支杆菌检测结果非常可靠。并且，比结核菌培养要快一到数个星期。PCR技术的敏感性和特异性和结核杆菌培养方法相当，但是这种敏感性是建立在液体培养体系之上的。利用固体培养和PCR技术进行对照是不合适的。
虽然我们总共检测了193例标本，但是只是对其中182例进行了PCR检测和常规方法检测之间的对比研究。剩下的11例由于标本量太小不能用常规方法检测。其中两例标本PCR检测的结果为阳性。PCR技术对于最低量为200μl标本均可以进行检测。
由于实验室诊断肺外结核存在困难以及没有可供利用的金标准，因此联合应用现有几种检测技术用于诊断结核疾病是一个比较理想的策略，这样可以使实验室为临床工作者提供更多的信息进行参考。
参考文献
[1] Rylancea J， Pai M， Lienhardtd C， Garner P. Priorities for tuberculosis research： a systematic review. Lancet Infect Dis. 2010；10：889-92.
[2] Sharma SK， Mohan A. Extrapulmonary tuberculosis. Indian J Med Res. 2004； 120： 316-53.
[3] Katoch VM. Newer Diagnostic Techniques for Tuberculosis. Ind J Med Res . 2004；120：418-28
[4] Hillemann D， Rusch-Gerdes S， Boehme C， Richter E. Rapid Molecular Detection of Extrapulmonary Tuberculosis by the Automated GeneXpert MTB/RIF System. J Clin Microbiol. 2011；49：1202-05.
[5 Portillo-Gómez L， Morris SL， Panduro A. Rapid and efficient detection of extra-pulmonary Mycobacterium tuberculosis by PCR analysis. Int J Tuberc Lung Dis . 2000；4：361-70.
[6] Amin I， Idrees M， Awan Z， Shahid M， Afzal S， Hussain A. PCR could be a method of choice for identification of both pulmonary and extra-pulmonary tuberculosis. BMC Research Notes. 2011；4：332.
【关键词】肺外结核；PCR 金标准
【文章编号】1004-7484（2014）06-3508-02
结核病是一项重大的公共健康问题。每年，世界范围内新增确诊病例超过900万，而登记在册的死亡病例将近200万[1]。肺外结核占所有免疫功能不全并罹患结核的病人总数的1/5。在HIV阳性个体中，肺外结核发病率非常高，占全部结核病例的50%[2]。由于此病对于标准的抗结核菌疗法比较敏感，所以早期精确的诊断至关重要。分子生物学方法是诊断肺外结核较好的一个选择，PCR技术具有较高的敏感性，特异性和诊断速度[3]。
1 材料和方法：
收集承德医学院附属医院2008年至2013年对193例疑似肺外结核的临床标本的检测结果。193例标本均进行PCR检测，其中11标本由于量比较小，而未进行常规方法检测。对剩余182例标本进行PCR检测和常规方法检测的对照分析。
首先将这些收集的标本进行匀浆化处理。然后对匀浆化的标本进行齐尼氏痰涂片，改良罗氏法培养和PCR技术检测。使用QIAampDNA微型试剂盒对DNA进行提取。
我们利用两种PCR体外诊断试剂盒【Real-TM（Sacace）J检测试剂盒以IS6110为靶序列设计引物，Seeplex多重分子检测诊断试剂盒（Seegene）以IS6110和MPB64为靶序列设计引物】对标本进行检测。所有接受PCR检测的标本均进行齐尼氏痰涂片检查以及改良罗氏法的细菌培养。我们对培养物进行了为8周的观察。
统计学分析：我们利用Kappa检验确定本研究中不同的检测方法的结果是否一致。利用卡方检验对于数据进行分析。统计学软件为SPSS20。
2 结果：在所有被检测的标本中肺外结核总阳性率为12.1%（表一）。其中PCR检测阳性为20例。结核菌培养阳性为9例，痰涂片法为6例。其中，经三种方法检测，仅PCR技术显示为阳性的标本为10例。而PCR检测为阴性，而常规方法检测为阳性的标本为2例。仅3例标本，三种检测方法结果均显示为阳性。PCR检测的阳性率在脓液标本中最高（表二）。
由于细菌培养在诊断结核并不是一项理想的金标准，我们应用Kappa检验来评价细菌培养和PCR技术检测结果的一致性水平。结果显示，两种方法的检测结果具有中等水平的一致性，Kappa值为0.59。
和痰涂片这种常规快速的检测方法相比，由PCR技术检测出来肺外结核阳性例数明显增多，具有统计学差异。同样，PCR检测出来的阳性病例也明显多于细菌培养的结果。PCR技术和两种方法联合检测的结果进行对照也具有统计学意义。
3 讨论：
在本研究中，182例疑似为肺外结核的病例标本，经不同的方法检测最终有22例得到确诊。本研究中， 细菌培养检测出的阳性率为3.3%。虽然细菌培养是诊断结核病的金标准，但是其缺乏敏感性、特异性和速度，尤其是在肺外结核的检测方面。
PCR诊断技术的特异性非常高，而关于敏感性的报道却并不一样。我们认为，只要运用合理，PCR技术在诊断肺外结核疾病方面具有非常高的敏感性[8]。本研究中，PCR技术在全部受检标本中检测出结核分枝杆菌的比例为11%。相关报道PCR技术在非呼吸系统标本检出结核杆菌的阳性率为8.6%-63%[9-11]。在本研究，经实验室诊断证实的病例中，由PCR技术检出的占90.9%，比例最高。而常规方法检测总共占到全部病例的54.6%。所有LJM检测为阳性的病例，也由PCR技术证实为阳性。
本研究显示，PCR技术是一项非常有效迅速的检测方法。将PCR技术和培养的检测结果进行对照分析，二者具有显著的统计学差异。而单独应用PCR技术和联合两种常规方法检测的结果之间对照发现，同样具有显著的统计学差异。在在我们的研究中，结核杆菌培养和PCR检测技术存在中等水平的一致性（k=0.59）。PCR技术和结核杆菌培养的结果并非完全一致。可能是由于PCR技术比常规方法的检测诊断效果更好。本研究显示，和其他诊断技术相比，PCR是诊断肺外结核最好的方法。
PCR技术对两例标本检测结果为阴性，而通过常规方法检测为阳性。我们排除了标本中存在PCR抑制剂的可能性，而其阴性的结果可能是由于IS6110插入序列片段复制物含量比较低的原因。目前为止，PCR技术的敏感性和结核病的诊断方面的相关理论还处于探索之中。WHO和其他健康机构现今仍然推荐结核菌培养作为诊断的金标准。
PCR技术在许多情况下已经成为了一项常规诊疗程序。因为其对标本的结核分支杆菌检测结果非常可靠。并且，比结核菌培养要快一到数个星期。PCR技术的敏感性和特异性和结核杆菌培养方法相当，但是这种敏感性是建立在液体培养体系之上的。利用固体培养和PCR技术进行对照是不合适的。
虽然我们总共检测了193例标本，但是只是对其中182例进行了PCR检测和常规方法检测之间的对比研究。剩下的11例由于标本量太小不能用常规方法检测。其中两例标本PCR检测的结果为阳性。PCR技术对于最低量为200μl标本均可以进行检测。
由于实验室诊断肺外结核存在困难以及没有可供利用的金标准，因此联合应用现有几种检测技术用于诊断结核疾病是一个比较理想的策略，这样可以使实验室为临床工作者提供更多的信息进行参考。
参考文献
[1] Rylancea J， Pai M， Lienhardtd C， Garner P. Priorities for tuberculosis research： a systematic review. Lancet Infect Dis. 2010；10：889-92.
[2] Sharma SK， Mohan A. Extrapulmonary tuberculosis. Indian J Med Res. 2004； 120： 316-53.
[3] Katoch VM. Newer Diagnostic Techniques for Tuberculosis. Ind J Med Res . 2004；120：418-28
[4] Hillemann D， Rusch-Gerdes S， Boehme C， Richter E. Rapid Molecular Detection of Extrapulmonary Tuberculosis by the Automated GeneXpert MTB/RIF System. J Clin Microbiol. 2011；49：1202-05.
[5 Portillo-Gómez L， Morris SL， Panduro A. Rapid and efficient detection of extra-pulmonary Mycobacterium tuberculosis by PCR analysis. Int J Tuberc Lung Dis . 2000；4：361-70.
[6] Amin I， Idrees M， Awan Z， Shahid M， Afzal S， Hussain A. PCR could be a method of choice for identification of both pulmonary and extra-pulmonary tuberculosis. BMC Research Notes. 2011；4：332.