论文部分内容阅读
念珠菌这个词起源于拉丁语“Candid”，意为白色的。念珠菌是具有二相性的真菌，孢子相是无致病性的，而当菌群失调或机体的抵抗力降低时，念珠菌就会产生具有侵入性以及致病力的假菌丝[1]。念珠菌作为内源性的共生菌，它的致病过程受很多因素影响，这不同于致病微生物以自身的毒力作为唯一的关键因素在致病过程中起作用。念珠菌是机会致病菌，因此无论是浅表真菌感染还是系统真菌感染都与机体生理状态有关[2]。念珠菌种有很多成员，临床常见的致病念珠菌包括白色念珠菌，光滑念珠菌，都柏林念珠菌，吉利蒙念珠菌，葡萄牙念珠菌，近平滑念珠菌，乳酒念珠菌，克柔念珠菌，热带念珠菌[3]。但是口腔中检出最多的还是白色念珠菌，包括带菌状态和感染状态，估计白色念珠菌占口腔检出念珠菌的80%，近年来非白念的比例有增高的趋势。在对人类致病性上，除了白色念珠菌，非白色念珠菌的重要性越来越多的得到公认。光滑念珠菌和克柔念珠菌被认为对某些抗真菌药物的耐药性增强。都柏林念珠菌是最近才发现的致病菌，1995年，首次在HIV感染者的念珠菌性口腔粘膜炎症患者的口腔标本中共同分离出白色念珠菌和都柏林念珠菌。随着HIV感染人群的增多以及抑制免疫的化疗药物的广泛应用，人们对条件致病的真菌越来越重视[4]。因此，对念珠菌种的分离鉴定不仅可以进一步了解它的致病力，还可以知道该菌对抗真菌药物敏感性，具有重要意义[5-6]。本文对口腔标本中念珠菌的分离和鉴定方法做一个全面的回顾。
1 念珠菌的致病力
念珠菌由非致病状态向致病状态转换的过程是复杂的，微妙的环境变化会导致其许多毒力因子的表达，这是宿主与菌体共同作用的结果，导致口腔念珠菌病的发生发展。无论患什么类型的念珠菌病，念珠菌只有能够停留在健康个体的粘膜表面才能发挥致病力，这一点在口腔尤为重要，因为口腔内的微生物每天都要对抗相对稳定的唾液的机械冲刷作用[7]。尽管有大量因素被证明可以促进念珠菌致病，但是没有一个是独立的致病因素。这些造成宿主细胞损伤的因素包括：念珠菌粘附相关因素（表面疏水性，粘附分子等），抵抗宿主的免疫（快速的表性转换，菌丝生长，补体分子粘附），释放水解酶（磷脂酶，天冬酰胺蛋白酶）。
2 口腔黏膜念珠菌病
Samaranayake提出把口腔黏膜念珠菌病分成两类：一类是原发的口腔黏膜念珠菌病，病变局限在口腔黏膜，不累及皮肤及其他黏膜；另一类是继发口腔黏膜念珠菌病，病损不仅存在于口腔黏膜还累及口外部位，如皮肤等，这类疾病通常与免疫系统缺陷有关，临床上较不常见。第一类病损包括三种经典类型：伪膜型，红斑型以及增生型，增生型还被细分为斑块型和结节型[8]。
3 口腔黏膜念珠菌病的诊断
口腔粘膜念珠菌病的诊断经常要靠临床特征，但是如果可能对样本进行微生物学检测则有助于定性及定量诊断念珠菌病，并且还可以对致病菌进行药敏试验。
4 口腔念珠菌的分离方法
口腔念珠菌的分离方法包括：涂片法，棉拭子法，印迹培养法[9]，全唾液收集培养[10]，漱口水浓缩培养[11]以及活检。每种方法都各有优缺点，取样方法的选择取决于病损局部的状况。确立病损且容易暴露的创面适合棉拭子或者印迹培养法直接取材，因为这样可以准确提供病损部位的微生物信息。而病损不明显或者病损部位隐匿不容易直接取材者适合唾液培养或者漱口液浓缩培养。对于念珠菌负荷的定量可以采用印记培养、漱口水培养法来计数，以区分念珠菌带菌状态或者感染状态，如果念珠菌高负荷则考虑后者。Silverman等[12]将500CFU/mL漱口液作为临界参考值，这说明口腔念珠菌负荷大于500CFU/mL漱口液时，患者都出现口腔念珠菌病表现，国内徐岩英等则以菌落数大于300CFU/ml漱口液定为念珠菌感染。
5 直接镜检
念珠菌的形态特征可作为鉴定的一方面，涂片可用于区分酵母样和菌丝体，比培养法敏感性[13]。KOH处理过的标本可显示出无色的带有45°分叉的菌丝。KOH标记荧光染料后，菌丝、酵母菌以及其他的菌体成分都会发荧光[14]。从病损局部取材的涂片经吉姆萨染色后，念珠菌的菌丝和酵母菌显示深蓝色；经过碘酸雪夫染色则显示红色或紫色[15]。对于慢性增生性粘膜念珠菌病，病损部位活检可经过碘酸雪夫染色或者六亚甲基四胺银染判断真菌侵入的深度，菌体成分被深染。真菌孢子、菌丝及假菌丝的存在就可以诊断感染真菌为念珠菌属，结合组织病理学特征则可以诊断为慢性增生性念珠菌[16]。
6 实验室培养
6.1 棉拭子法：病损局部的棉拭子法是相对简单的方法，用来检测念珠菌的生长以及半定量，取材方法为用灭菌的棉拭子轻轻地涂搽病损局部然后接种在沙氏平板培养基上[17]。
6.2漱口法：让患者用10mlPBS（0.01M，pH7.2）含漱1min吐出，然后经10倍离心浓缩后取50μL接种于沙氏琼脂平板培养基上，37℃培养24～48h后计数菌落，计算每毫升漱口水的念珠菌克隆形成[13]。
6.3印迹培养法：印迹法采用无菌的泡沫板（一般2.5cm），使用前浸泡在沙氏肉汤液体培养基中，然后放在口内病损部位停留30s，后转入培养基继续培养[17]。
7 培养基
念珠菌培养的初级培养基是沙氏（SDA）培养基[18]，因为其pH值较低，可抑制口腔细菌的生长而有利于念珠菌生长，在培养基中加入抗生素可进一步增强这种选择性。一般培养条件为37℃、有氧环境，培养24～48h后，念珠菌会在SDA培养基上形成的菌落呈奶油状、表面光滑、白色突起有浓酵母气味，培养时间稍久则菌落增大，颜色变深 。但是无法进行种间鉴别。据估计大约10%的口腔样本存在一种以上的念珠菌，因此对非白色念珠菌的鉴别能力逐渐变得更为重要[13]。
近年来，许多不同的鉴定培养基被开发出来，可以根据菌落的形态和颜色区分不同菌种，这种培养基的优势在于可以用来鉴别混合感染的标本。这类培养基包括：Pagano-Levin 琼脂培养基和许多商品化的显色培养基：（如：CHROMagar Candida，Albicans ID，Fluroplate，Candichrom albicans）[13]。Pagano- Levin琼脂培养基鉴别念珠菌是基于其还原氯三苯四唑的特点，该培养基上生长的白色念珠菌为苍白色菌落，而与其他念珠菌的菌落为不同程度的粉色相区分。Pagano-Levin培养基与SDA培养基敏感度相似，但是因为可区分一种以上的念珠菌而优于SDA培养基[19]。CHROMagar Candida 培養基可根据菌落的形态和颜色鉴别白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌和克柔念珠菌[20]。Albicans ID和Fluroplate对白色念珠菌的鉴定更有优势[21]。CHROMagar Candida对白色念珠菌的鉴定准确率为95%[22]，而Albicans ID和Fluroplate的准确率为98.6%[21]。CHROMagar Candida 培养基作为初步分离的培养基据说可以将新发现的都柏林念珠菌与白色念珠菌相鉴别[23]，据报导前者的菌落颜色为深绿色从而与白色念珠菌相区分[24]。但是，在传代培养或者标本保存后培养时两者的区别会变得不明显。最近发现都柏林念珠菌无法在45℃孵化条件下生长，可以此来与白色念珠菌相鉴别[25]。 8 念珠菌的鉴定
8.1 形态鉴定：芽管实验是实验室鉴定白色念珠菌的标准方法，该实验包括在马血清培养基中37℃培养2～4h诱导菌丝（芽管）产生，大约95%的白色念珠菌都会产生芽管，星形念珠菌和都柏林念珠菌也具有这项特性[13]。白色念珠菌与都柏林念珠菌能够产生特征性形态-厚壁孢子，依此可与其他念珠菌相区别。厚壁孢子是真菌在营养缺乏的培养基上如玉米琼脂培养基上传代培养时，在菌丝末端形成的反光的球形结构。可在37℃孵育24～48h后镜检厚壁孢子形成情况。
8.2 生理生化鉴定：生化鉴定主要基于真菌生长时利用碳水化合物的情况，在传统的实验中基本的琼脂培养基缺乏碳源，碳水化合物溶液被加在已经接种标本的琼脂培养基的小孔中或者琼脂表面的滤纸片上。若碳源周围有生长则代表利用碳水化合物，商品化的鉴定系统也是基于这个原理，只是碳水化合物实验被局限在检测条上的一排小孔中，在特定的鉴定体系中每个孔的生长情况根据浊度或者颜色该变来读取，实验得到的大量结果通过数据比较得出鉴定结果[26]。
8.3血清学鉴定：血清学检测常常被用来明确念珠菌的临床特征，白色念珠菌的IgG抗体滴度增加也许反映具有免疫能力的个体正在经受侵入性真菌的感染。IgA和IgM抗体的检出是反映急性感染的指标，免疫缺陷个体抗体滴度变化很大。因此，在这种情况下推荐抗原检测。酶联免疫吸附试验（ELISA）或者放射免疫分析（RIA）可用于检测念珠菌的抗原，在发达国家念珠菌的细胞壁甘露聚糖或者细胞质的成分都可作为抗原检测的目标[27]。血清学诊断经常是滞后的，并且缺乏敏感性和特异性。而且，免疫缺陷患者，抗体产生变化很大，使得诊断更加复杂[28]。这主要是因为真菌抗原及代谢产物会很快地被机体从循环系统清除掉，而抗体的存在并不能代表真菌感染，尤其对于那些有严重潜在疾病或者服用免疫抑制药物的患者[29]。深部真菌感染患者通常伴有机体免疫应答功能的严重低下，所产生的抗体效价较低，且真菌之间存在交叉抗原，不可避免地存在假阳性和假阴性，限制了血清学试验在真菌感染诊断上的应用。
血清学实验无法用来诊断口腔念珠菌病，然而可以用来推测预后，尤其对于那些患严重口腔念珠菌病且对抗真菌治疗效果不佳的患者[30]。
8.4分子鉴定：目前飞速发展的分子生物学技术为病原真菌的生物学特性研究提供了可能，聚合酶链反应（PCR）检测方法自 1984 年创立以来，已经成为分子生物学领域的核心技术，在对于医学重要真菌的检测中，PCR 技术及其相关技术占据了重要位置，并且不断被应用于真菌感染的诊断和菌种鉴定中，可以使感染菌种的确立与快速诊断进一步完成。通过分析遗传变异性来鉴定比通过表型鉴定更可靠。因为念珠菌的遗传变异性的鉴定是分析通过凝胶电泳或者DNA-DNA杂交得到的电泳核型的差异、限制性片段长度多态性来实现的[13]。很多种属特异的PCR方法被用于念珠菌的种间鉴定。尽管最经常被扩增的基因是核糖体RNA操纵子，据报道有几个靶基因可用于念珠菌的种间鉴别，通过凝胶电泳分离的PCR产物大小、直接测序或者经过限制性核酸内切酶对PCR产物酶切后进行限制性片段分析来了解基因序列的变化。利用肽核酸方法的荧光原位杂交（PNA Fish）可以瞄準活的白色念珠菌菌体内充足的rRNA上高度保守的种属特异的序列，活的菌体可不用经过扩增直接进行检测[31]，这项技术的准确率为98.7%～100%，特异性为100%[32]。基于分子水平的技术也可用来鉴定念珠菌种型，例如：脉冲场凝胶电泳（PFGE）、随机扩增多肽DNA（RAPD）分析、重复序列扩增PCR（REP），这些技术在口腔念珠菌病的流行病学研究方面被广泛应用。
9 小结
近年来，对于临床采集的念珠菌标本的鉴定越来越重视，本文将念珠菌的分离与鉴定程序用模式图的方式做图表总结（见图1）。既然念珠菌是口腔常驻菌，必须有合适的方法来确定它的存在及判断真菌的负荷。鉴定感染的念珠菌的种型更为重要，因为念珠菌的种型很多，并且不同种型念珠菌在致病性和对抗真菌药物的敏感性方面有所不同。目前，可以通过芽管诱导实验，显色培养基鉴定，生化鉴定来进行种属鉴定。另外，还有广泛用于流行病学研究的分子分型技术作补充。
[参考文献]
[1]Zunt SL. Oral candidiasis： diagnosis and treartment[J]. J Practic Hygiene，2000，9（2）：31-36.
[2]Soysa NS，Samaranayake LP，Ellepola ANB.Antimicrobials as a contributory factor in oral candidosis-a brief overview[J].Oral Diseases，2008，14（2）：138-143.
[3]Scully C，Ei-Kabir M，Samaranayake LP.Candida and oral candidosis： a review[J].Crit Rev Oral Biol Medi，1994，5（2）：125-157.
[4]Epstein JB，Komiyama K，Duncan D.Oral topical steroids and secondary oral candidiasis[J].J Oral Med，1986，41（4）：223-227.
[5]Allen CM，Saffer A，Meister RK，et al.Comparison of a lesion-inducing isolate and a nonlesional isolate of Candida albicans in an immunosuppressed rat model of oral candidiasis[J].J Oral Pathol Med，1994，23（3）：133-139. [6]McIlroy MA.Failure of fluconazole to suppress fungemia in a patient with fever， neutropenia and typhlitis[J].J Infecti Diseases，1991，163（2）：420-421.
[7]Sitheeque MAM，Samaranayake LP.Chronic hyperplastic candidosis/candidiasis （candidal leukoplakia）[J].Critical Reviews in Oral Biology and Medicine，2003，14（4）：253-267.
[8]Holmstrup P，Bessermann M.Clinical， therapeutic， and pathogenic aspects of chronic oral multifocal candidiasis[J].Oral Surg Oral Medi Oral Pathol，1983，56（4）： 388-395.
[9]Davenport JC.The oral distribution of Candida in denture stomatitis[J]. Bri Dent J， 1970，129（4）：151-156.
[10]Oliver DE，Shillitoe EJ.Effects of smoking on the prevalence and intraoral distribution of Candida albicans[J].Journal of Oral Pathology，1984，13（3）：265-270.
[11]Samaranayake LP，MacFarlane TW，Lamey PJ，et al.A comparison of oral rinse and imprint sampling techniques for the detection of yeast， coliform and Staphylococcus aureus carriage in the oral cavity[J].J Oral Pathol，1986，15（7）：386-388.
[12]Silverman SJr，Gallo JW，Mcknight M，et al.Clinical characteristicsand management responses in 85 HIV-infected patients with oral candidiasis[J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Pathol Oral Radjol Endod，2005，83（4）：402.
[13]Williams DW，Lewis MAO.Isolation and identification of Candida from the oral cavity[J].Oral Diseases， 2000，6（1）：3-11.
[14]Harrington BJ，Hageage GJ.Calcofluor white： tips for improving its use[J].Clinical Microbiology Newsletter，1991，13（1）：3-5.
[15]Davenport JC，Wilton JMA.Incidence of immediateand delayed hypersensitivity to Candida albicans in denture stomatitis[J].J Dent Res，1971，50（4）：892-896.
[16]Nassar A，Zapata M，Little JV，et al.Utility of reflex gomori methenamine silver staining for Pneumocystis jirovecii on bronchoalveolar lavage cytologic specimens： a review[J].Diagnostic Cytopathology，2006，34（11）： 719-723.
[17]Axell T，Simonsson T，Birkhed D，et al .Evaluation of a simplified diagnostic aid（Oricult-N） for detection of oral candidoses[J].Scandinavian J Dent Res，1985，93（1）：52-55.
[18]Odds FC.Sabouraud（'s） agar[J].J Med Veterin Mycol，1991，29：355-359.
[19]Samaranayake LP，MacFarlane TW，Williamson MI.Comparison of Sabouraud dextrose and Pagano-Levin agar media for detection and isolation of yeasts from oral samples[J].J Clin Microbiol，1987，25（1）： 162-164.
[20]Beighton D，Ludford R，Clark DT，et al.Use of CHROMagar Candida medium for isolation of yeasts from dental samples[J].J Clini Microbiol，1995，33（11）：3025-3027. [21]Rousselle P， Freydiere AM，Couillerot PJ，et al.Rapid identification of Candida albicans by using albicans ID and fluoroplate agar plates[J].J Clini Microbiol，1994，32（12）： 3034-3036.
[22]Pfaller MA，Houston A，Coffmann S.Application of CHROMagar Candida for rapid screening of clinical specimens for Candida albicans， Candida tropicalis， Candida krusei， and Candida （Torulopsis） glabrata[J]. J Clin Microbiol，1996，34（1）： 58-61.
[23]Sullivan DJ，Westerneng TJ，Haynes KA，et al.Candida dubliniensis sp. nov.： phenotypic and molecular characterization of a novel species associated with oral candidosis in HIV-infected individuals[J]. Microbiology，1995，141（7）：1507-1521.
[24]Schoofs A，Odds FC，Colebunders R，et al.Use of specialised isolation media for recognition and identification of Candida dubliniensis isolates from HIVinfected patients[J].European J Clini MicrobiolInfect Diseases，1997，16（4）：296-300.
[25]Pinjon E，Sullivan D，Salkin I，et al.Simple， inexpensive， reliable method for differentiation of Candida dubliniensis from Candida albicans[J].J Clin Microbiol，1998，36（7）：2093-2095.
[26]Ellepola ANB，Morrison CJ.Laboratory diagnosis of invasive candidiasis[J]. J Microbiol， 2005，43：65-84.
[27]Aubert D，Puygauthier-Toubas D，Leon P，et al.Characterization of specific anti-Candida IgM， IgA and IgE： diagnostic value in deep-seated infections[J].Mycoses，1996，39（5）：169-176.
[28]Wahyuningsih R，Freisleben HJ，Sonntag HG，et al.Simple and rapid detection of Candida albicans DNA in serum by PCR for diagnosis of invasive candidiasis[J].J Clin Microbiol，2000，38（8）： 3016-3021.
[29]Yeo SF，Wong B.Current status of nonculture methods for diagnosis of invasive fungal infections[J]. Clin Microbiol Rev，2002，15（3）： 465-484.
[30]Budtz-Jorgensen E.Histopathology， immunology， and serology of oral yeast infections. Diagnosis of oral candidosis[J].Acta Odontologica Scandinavica，1990，48（1）：37-43.
[31]Shepard JR，Addison RM，Alexander BD，et al.Multicenter evaluation of the Candida albicans/Candida glabrata peptide nucleic acid fluorescent in situ hybridization methodfor simultaneous dual-color identification of C. albicans and C. glabrata directly from blood culture bottles[J].J Clin Microbiol，2008，46（1）：50-55.
[32]Trnovsky J，Merz W，Della-Latta P，et al.Rapid and accurate identification of Candida albicans isolates by use of PNA FISHFlow[J].J Clin Microbiol，2008，46（4）：1537-1540.
[收稿日期]2012-10-13 [修回日期]2012-12-09
編辑/李阳利
1 念珠菌的致病力
念珠菌由非致病状态向致病状态转换的过程是复杂的，微妙的环境变化会导致其许多毒力因子的表达，这是宿主与菌体共同作用的结果，导致口腔念珠菌病的发生发展。无论患什么类型的念珠菌病，念珠菌只有能够停留在健康个体的粘膜表面才能发挥致病力，这一点在口腔尤为重要，因为口腔内的微生物每天都要对抗相对稳定的唾液的机械冲刷作用[7]。尽管有大量因素被证明可以促进念珠菌致病，但是没有一个是独立的致病因素。这些造成宿主细胞损伤的因素包括：念珠菌粘附相关因素（表面疏水性，粘附分子等），抵抗宿主的免疫（快速的表性转换，菌丝生长，补体分子粘附），释放水解酶（磷脂酶，天冬酰胺蛋白酶）。
2 口腔黏膜念珠菌病
Samaranayake提出把口腔黏膜念珠菌病分成两类：一类是原发的口腔黏膜念珠菌病，病变局限在口腔黏膜，不累及皮肤及其他黏膜；另一类是继发口腔黏膜念珠菌病，病损不仅存在于口腔黏膜还累及口外部位，如皮肤等，这类疾病通常与免疫系统缺陷有关，临床上较不常见。第一类病损包括三种经典类型：伪膜型，红斑型以及增生型，增生型还被细分为斑块型和结节型[8]。
3 口腔黏膜念珠菌病的诊断
口腔粘膜念珠菌病的诊断经常要靠临床特征，但是如果可能对样本进行微生物学检测则有助于定性及定量诊断念珠菌病，并且还可以对致病菌进行药敏试验。
4 口腔念珠菌的分离方法
口腔念珠菌的分离方法包括：涂片法，棉拭子法，印迹培养法[9]，全唾液收集培养[10]，漱口水浓缩培养[11]以及活检。每种方法都各有优缺点，取样方法的选择取决于病损局部的状况。确立病损且容易暴露的创面适合棉拭子或者印迹培养法直接取材，因为这样可以准确提供病损部位的微生物信息。而病损不明显或者病损部位隐匿不容易直接取材者适合唾液培养或者漱口液浓缩培养。对于念珠菌负荷的定量可以采用印记培养、漱口水培养法来计数，以区分念珠菌带菌状态或者感染状态，如果念珠菌高负荷则考虑后者。Silverman等[12]将500CFU/mL漱口液作为临界参考值，这说明口腔念珠菌负荷大于500CFU/mL漱口液时，患者都出现口腔念珠菌病表现，国内徐岩英等则以菌落数大于300CFU/ml漱口液定为念珠菌感染。
5 直接镜检
念珠菌的形态特征可作为鉴定的一方面，涂片可用于区分酵母样和菌丝体，比培养法敏感性[13]。KOH处理过的标本可显示出无色的带有45°分叉的菌丝。KOH标记荧光染料后，菌丝、酵母菌以及其他的菌体成分都会发荧光[14]。从病损局部取材的涂片经吉姆萨染色后，念珠菌的菌丝和酵母菌显示深蓝色；经过碘酸雪夫染色则显示红色或紫色[15]。对于慢性增生性粘膜念珠菌病，病损部位活检可经过碘酸雪夫染色或者六亚甲基四胺银染判断真菌侵入的深度，菌体成分被深染。真菌孢子、菌丝及假菌丝的存在就可以诊断感染真菌为念珠菌属，结合组织病理学特征则可以诊断为慢性增生性念珠菌[16]。
6 实验室培养
6.1 棉拭子法：病损局部的棉拭子法是相对简单的方法，用来检测念珠菌的生长以及半定量，取材方法为用灭菌的棉拭子轻轻地涂搽病损局部然后接种在沙氏平板培养基上[17]。
6.2漱口法：让患者用10mlPBS（0.01M，pH7.2）含漱1min吐出，然后经10倍离心浓缩后取50μL接种于沙氏琼脂平板培养基上，37℃培养24～48h后计数菌落，计算每毫升漱口水的念珠菌克隆形成[13]。
6.3印迹培养法：印迹法采用无菌的泡沫板（一般2.5cm），使用前浸泡在沙氏肉汤液体培养基中，然后放在口内病损部位停留30s，后转入培养基继续培养[17]。
7 培养基
念珠菌培养的初级培养基是沙氏（SDA）培养基[18]，因为其pH值较低，可抑制口腔细菌的生长而有利于念珠菌生长，在培养基中加入抗生素可进一步增强这种选择性。一般培养条件为37℃、有氧环境，培养24～48h后，念珠菌会在SDA培养基上形成的菌落呈奶油状、表面光滑、白色突起有浓酵母气味，培养时间稍久则菌落增大，颜色变深 。但是无法进行种间鉴别。据估计大约10%的口腔样本存在一种以上的念珠菌，因此对非白色念珠菌的鉴别能力逐渐变得更为重要[13]。
近年来，许多不同的鉴定培养基被开发出来，可以根据菌落的形态和颜色区分不同菌种，这种培养基的优势在于可以用来鉴别混合感染的标本。这类培养基包括：Pagano-Levin 琼脂培养基和许多商品化的显色培养基：（如：CHROMagar Candida，Albicans ID，Fluroplate，Candichrom albicans）[13]。Pagano- Levin琼脂培养基鉴别念珠菌是基于其还原氯三苯四唑的特点，该培养基上生长的白色念珠菌为苍白色菌落，而与其他念珠菌的菌落为不同程度的粉色相区分。Pagano-Levin培养基与SDA培养基敏感度相似，但是因为可区分一种以上的念珠菌而优于SDA培养基[19]。CHROMagar Candida 培養基可根据菌落的形态和颜色鉴别白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌和克柔念珠菌[20]。Albicans ID和Fluroplate对白色念珠菌的鉴定更有优势[21]。CHROMagar Candida对白色念珠菌的鉴定准确率为95%[22]，而Albicans ID和Fluroplate的准确率为98.6%[21]。CHROMagar Candida 培养基作为初步分离的培养基据说可以将新发现的都柏林念珠菌与白色念珠菌相鉴别[23]，据报导前者的菌落颜色为深绿色从而与白色念珠菌相区分[24]。但是，在传代培养或者标本保存后培养时两者的区别会变得不明显。最近发现都柏林念珠菌无法在45℃孵化条件下生长，可以此来与白色念珠菌相鉴别[25]。 8 念珠菌的鉴定
8.1 形态鉴定：芽管实验是实验室鉴定白色念珠菌的标准方法，该实验包括在马血清培养基中37℃培养2～4h诱导菌丝（芽管）产生，大约95%的白色念珠菌都会产生芽管，星形念珠菌和都柏林念珠菌也具有这项特性[13]。白色念珠菌与都柏林念珠菌能够产生特征性形态-厚壁孢子，依此可与其他念珠菌相区别。厚壁孢子是真菌在营养缺乏的培养基上如玉米琼脂培养基上传代培养时，在菌丝末端形成的反光的球形结构。可在37℃孵育24～48h后镜检厚壁孢子形成情况。
8.2 生理生化鉴定：生化鉴定主要基于真菌生长时利用碳水化合物的情况，在传统的实验中基本的琼脂培养基缺乏碳源，碳水化合物溶液被加在已经接种标本的琼脂培养基的小孔中或者琼脂表面的滤纸片上。若碳源周围有生长则代表利用碳水化合物，商品化的鉴定系统也是基于这个原理，只是碳水化合物实验被局限在检测条上的一排小孔中，在特定的鉴定体系中每个孔的生长情况根据浊度或者颜色该变来读取，实验得到的大量结果通过数据比较得出鉴定结果[26]。
8.3血清学鉴定：血清学检测常常被用来明确念珠菌的临床特征，白色念珠菌的IgG抗体滴度增加也许反映具有免疫能力的个体正在经受侵入性真菌的感染。IgA和IgM抗体的检出是反映急性感染的指标，免疫缺陷个体抗体滴度变化很大。因此，在这种情况下推荐抗原检测。酶联免疫吸附试验（ELISA）或者放射免疫分析（RIA）可用于检测念珠菌的抗原，在发达国家念珠菌的细胞壁甘露聚糖或者细胞质的成分都可作为抗原检测的目标[27]。血清学诊断经常是滞后的，并且缺乏敏感性和特异性。而且，免疫缺陷患者，抗体产生变化很大，使得诊断更加复杂[28]。这主要是因为真菌抗原及代谢产物会很快地被机体从循环系统清除掉，而抗体的存在并不能代表真菌感染，尤其对于那些有严重潜在疾病或者服用免疫抑制药物的患者[29]。深部真菌感染患者通常伴有机体免疫应答功能的严重低下，所产生的抗体效价较低，且真菌之间存在交叉抗原，不可避免地存在假阳性和假阴性，限制了血清学试验在真菌感染诊断上的应用。
血清学实验无法用来诊断口腔念珠菌病，然而可以用来推测预后，尤其对于那些患严重口腔念珠菌病且对抗真菌治疗效果不佳的患者[30]。
8.4分子鉴定：目前飞速发展的分子生物学技术为病原真菌的生物学特性研究提供了可能，聚合酶链反应（PCR）检测方法自 1984 年创立以来，已经成为分子生物学领域的核心技术，在对于医学重要真菌的检测中，PCR 技术及其相关技术占据了重要位置，并且不断被应用于真菌感染的诊断和菌种鉴定中，可以使感染菌种的确立与快速诊断进一步完成。通过分析遗传变异性来鉴定比通过表型鉴定更可靠。因为念珠菌的遗传变异性的鉴定是分析通过凝胶电泳或者DNA-DNA杂交得到的电泳核型的差异、限制性片段长度多态性来实现的[13]。很多种属特异的PCR方法被用于念珠菌的种间鉴定。尽管最经常被扩增的基因是核糖体RNA操纵子，据报道有几个靶基因可用于念珠菌的种间鉴别，通过凝胶电泳分离的PCR产物大小、直接测序或者经过限制性核酸内切酶对PCR产物酶切后进行限制性片段分析来了解基因序列的变化。利用肽核酸方法的荧光原位杂交（PNA Fish）可以瞄準活的白色念珠菌菌体内充足的rRNA上高度保守的种属特异的序列，活的菌体可不用经过扩增直接进行检测[31]，这项技术的准确率为98.7%～100%，特异性为100%[32]。基于分子水平的技术也可用来鉴定念珠菌种型，例如：脉冲场凝胶电泳（PFGE）、随机扩增多肽DNA（RAPD）分析、重复序列扩增PCR（REP），这些技术在口腔念珠菌病的流行病学研究方面被广泛应用。
9 小结
近年来，对于临床采集的念珠菌标本的鉴定越来越重视，本文将念珠菌的分离与鉴定程序用模式图的方式做图表总结（见图1）。既然念珠菌是口腔常驻菌，必须有合适的方法来确定它的存在及判断真菌的负荷。鉴定感染的念珠菌的种型更为重要，因为念珠菌的种型很多，并且不同种型念珠菌在致病性和对抗真菌药物的敏感性方面有所不同。目前，可以通过芽管诱导实验，显色培养基鉴定，生化鉴定来进行种属鉴定。另外，还有广泛用于流行病学研究的分子分型技术作补充。
[参考文献]
[1]Zunt SL. Oral candidiasis： diagnosis and treartment[J]. J Practic Hygiene，2000，9（2）：31-36.
[2]Soysa NS，Samaranayake LP，Ellepola ANB.Antimicrobials as a contributory factor in oral candidosis-a brief overview[J].Oral Diseases，2008，14（2）：138-143.
[3]Scully C，Ei-Kabir M，Samaranayake LP.Candida and oral candidosis： a review[J].Crit Rev Oral Biol Medi，1994，5（2）：125-157.
[4]Epstein JB，Komiyama K，Duncan D.Oral topical steroids and secondary oral candidiasis[J].J Oral Med，1986，41（4）：223-227.
[5]Allen CM，Saffer A，Meister RK，et al.Comparison of a lesion-inducing isolate and a nonlesional isolate of Candida albicans in an immunosuppressed rat model of oral candidiasis[J].J Oral Pathol Med，1994，23（3）：133-139. [6]McIlroy MA.Failure of fluconazole to suppress fungemia in a patient with fever， neutropenia and typhlitis[J].J Infecti Diseases，1991，163（2）：420-421.
[7]Sitheeque MAM，Samaranayake LP.Chronic hyperplastic candidosis/candidiasis （candidal leukoplakia）[J].Critical Reviews in Oral Biology and Medicine，2003，14（4）：253-267.
[8]Holmstrup P，Bessermann M.Clinical， therapeutic， and pathogenic aspects of chronic oral multifocal candidiasis[J].Oral Surg Oral Medi Oral Pathol，1983，56（4）： 388-395.
[9]Davenport JC.The oral distribution of Candida in denture stomatitis[J]. Bri Dent J， 1970，129（4）：151-156.
[10]Oliver DE，Shillitoe EJ.Effects of smoking on the prevalence and intraoral distribution of Candida albicans[J].Journal of Oral Pathology，1984，13（3）：265-270.
[11]Samaranayake LP，MacFarlane TW，Lamey PJ，et al.A comparison of oral rinse and imprint sampling techniques for the detection of yeast， coliform and Staphylococcus aureus carriage in the oral cavity[J].J Oral Pathol，1986，15（7）：386-388.
[12]Silverman SJr，Gallo JW，Mcknight M，et al.Clinical characteristicsand management responses in 85 HIV-infected patients with oral candidiasis[J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Pathol Oral Radjol Endod，2005，83（4）：402.
[13]Williams DW，Lewis MAO.Isolation and identification of Candida from the oral cavity[J].Oral Diseases， 2000，6（1）：3-11.
[14]Harrington BJ，Hageage GJ.Calcofluor white： tips for improving its use[J].Clinical Microbiology Newsletter，1991，13（1）：3-5.
[15]Davenport JC，Wilton JMA.Incidence of immediateand delayed hypersensitivity to Candida albicans in denture stomatitis[J].J Dent Res，1971，50（4）：892-896.
[16]Nassar A，Zapata M，Little JV，et al.Utility of reflex gomori methenamine silver staining for Pneumocystis jirovecii on bronchoalveolar lavage cytologic specimens： a review[J].Diagnostic Cytopathology，2006，34（11）： 719-723.
[17]Axell T，Simonsson T，Birkhed D，et al .Evaluation of a simplified diagnostic aid（Oricult-N） for detection of oral candidoses[J].Scandinavian J Dent Res，1985，93（1）：52-55.
[18]Odds FC.Sabouraud（'s） agar[J].J Med Veterin Mycol，1991，29：355-359.
[19]Samaranayake LP，MacFarlane TW，Williamson MI.Comparison of Sabouraud dextrose and Pagano-Levin agar media for detection and isolation of yeasts from oral samples[J].J Clin Microbiol，1987，25（1）： 162-164.
[20]Beighton D，Ludford R，Clark DT，et al.Use of CHROMagar Candida medium for isolation of yeasts from dental samples[J].J Clini Microbiol，1995，33（11）：3025-3027. [21]Rousselle P， Freydiere AM，Couillerot PJ，et al.Rapid identification of Candida albicans by using albicans ID and fluoroplate agar plates[J].J Clini Microbiol，1994，32（12）： 3034-3036.
[22]Pfaller MA，Houston A，Coffmann S.Application of CHROMagar Candida for rapid screening of clinical specimens for Candida albicans， Candida tropicalis， Candida krusei， and Candida （Torulopsis） glabrata[J]. J Clin Microbiol，1996，34（1）： 58-61.
[23]Sullivan DJ，Westerneng TJ，Haynes KA，et al.Candida dubliniensis sp. nov.： phenotypic and molecular characterization of a novel species associated with oral candidosis in HIV-infected individuals[J]. Microbiology，1995，141（7）：1507-1521.
[24]Schoofs A，Odds FC，Colebunders R，et al.Use of specialised isolation media for recognition and identification of Candida dubliniensis isolates from HIVinfected patients[J].European J Clini MicrobiolInfect Diseases，1997，16（4）：296-300.
[25]Pinjon E，Sullivan D，Salkin I，et al.Simple， inexpensive， reliable method for differentiation of Candida dubliniensis from Candida albicans[J].J Clin Microbiol，1998，36（7）：2093-2095.
[26]Ellepola ANB，Morrison CJ.Laboratory diagnosis of invasive candidiasis[J]. J Microbiol， 2005，43：65-84.
[27]Aubert D，Puygauthier-Toubas D，Leon P，et al.Characterization of specific anti-Candida IgM， IgA and IgE： diagnostic value in deep-seated infections[J].Mycoses，1996，39（5）：169-176.
[28]Wahyuningsih R，Freisleben HJ，Sonntag HG，et al.Simple and rapid detection of Candida albicans DNA in serum by PCR for diagnosis of invasive candidiasis[J].J Clin Microbiol，2000，38（8）： 3016-3021.
[29]Yeo SF，Wong B.Current status of nonculture methods for diagnosis of invasive fungal infections[J]. Clin Microbiol Rev，2002，15（3）： 465-484.
[30]Budtz-Jorgensen E.Histopathology， immunology， and serology of oral yeast infections. Diagnosis of oral candidosis[J].Acta Odontologica Scandinavica，1990，48（1）：37-43.
[31]Shepard JR，Addison RM，Alexander BD，et al.Multicenter evaluation of the Candida albicans/Candida glabrata peptide nucleic acid fluorescent in situ hybridization methodfor simultaneous dual-color identification of C. albicans and C. glabrata directly from blood culture bottles[J].J Clin Microbiol，2008，46（1）：50-55.
[32]Trnovsky J，Merz W，Della-Latta P，et al.Rapid and accurate identification of Candida albicans isolates by use of PNA FISHFlow[J].J Clin Microbiol，2008，46（4）：1537-1540.
[收稿日期]2012-10-13 [修回日期]2012-12-09
編辑/李阳利