论文部分内容阅读
摘要[目的]利用综合倍性育种和杂交优势的多倍体育种培育山杨优良新品种。[方法]以中国山杨及其杂交品种中美山杨为母本，山杨和新疆杨为父本，进行树上杂交与切枝水培杂交，对授粉后的雌花序施加秋水仙碱进行多倍体诱导，利用流式细胞术检测植株倍性。[结果]切枝水培杂交，授粉48 h后，以浓度0.3%秋水仙碱持续处理24 h，诱导三倍体效果最佳；授粉96 h后，以浓度0.3%秋水仙碱持续处理24 h，诱导四倍体效果最佳。另外树上杂交，授粉96 h后，以浓度0.1%秋水仙碱持续处理48 h，诱导三倍体效果最佳；授粉120 h后，以浓度0.1%秋水仙碱持续处理48 h，诱导四倍体效果最佳。[结论]对山杨、中美山杨授粉后施加秋水仙碱处理，成功获得了三倍体与四倍体，结果表明利用秋水仙碱溶液诱导山杨多倍体行之有效。
关键词山杨；多倍体；秋水仙碱
中图分类号S792.11文献标识码A文章编号0517-6611（2014）04-01098-03
基金项目黑龙江省森工总局基础研究项目（sgzjY2013003、sgzjY2010012）；黑龙江省财政厅自拟项目（201204，201303）。
作者简介李静（1986-），女，山东临邑人，硕士研究生，研究方向：杨树倍性育种。*通讯作者，副教授，从事细胞活性物质利用研究。
山杨（Populus davidiana Dode.）属白杨派，又称中国山杨，在我国广泛分布，抗寒、耐旱，是撂荒地、采伐迹地和火烧迹地森林更新的先锋树种。山杨木材结构均匀、质轻而软、颜色淡白，纤维长、宽、长宽比和纤维素含量等均高于大青杨、香杨和小黑杨等，不用填充其他原料即可用于造纸[1]。山杨这些特性在短周期纸浆材等森林工业用材生产中具有明显优势[2-4]。近年来，随着经济的快速发展，我国对纸张的需求骤增，同时对纸张品质的要求也在不断提高。山杨作为优质纸浆原材，其可利用的天然林日渐减少，此时就需要营造大量人工林来填补天然林供应不足的空缺。
国内外有关倍性育种的实践证明，多倍体育种由于染色体倍数性增加，常常带来一些形态和生理上的变化，其在提高种子生长速度、增进遗传品质以及提高目的代谢物含量等方面具有优势，可以通过一轮次育种过程实现多目标性状遗传改良。杨树多倍体在材积生长量、木材品质以及抗性方面具有很大优势[5-8]。目前关于山杨的遗传改良主要集中于选优、杂交育种等方面，迄今未见有关山杨多倍体诱导成功的研究报道。该研究主要以山杨及其杂种为材料，对授粉后施加秋水仙碱溶液诱导山杨多倍体的技术条件进行了初步探索。
1 材料与方法
1.1 试验材料以山杨以及杂交品种中美山杨为母本，山杨和新疆杨为父本。其中山杨取自黑龙江省林口县青山林场山杨基因保存林，新疆杨取自阿克苏地区，中美山杨取自黑龙江省林业科学院院内保存林，是引进生长优异的美洲山杨花粉与优良种源的中国山杨进行地理远源杂交选育出的优良品种。
于2月上旬，收集杨树枝条，选择直径为1～2 cm，无病虫害、带有花芽的、健壮的枝条，将雌花枝剪成1.5～2.0 m长，雄花枝剪成1.0 m左右，用塑料薄膜将上述花枝包裹后带回哈尔滨，低温保存备用[9]。
1.2研究方法
1.2.1 杂交育种。杂交育种分为树上杂交与切枝水培杂交。树上杂交利用的是位于黑龙江省林业科学院院内的中美山杨保存林。切枝水培杂交以山杨为母本。首先将选择好的雄花枝进行室内切枝水培，收集花粉，干燥，贮藏于4 ℃冰箱备用。观察雌花发育情况，到可授期时分别用上述花粉授粉[10-12]。
1.2.2 利用秋水仙碱诱导加倍。授粉后施加秋水仙碱处理诱导加倍，自授粉48 h后，对雌花序进行秋水仙碱诱导处理，处理方式为瓶浸法，秋水仙碱溶液浓度为0.1%、0.3%、0.5%，切枝杂交为处理持续时间24、36、48 h，树上杂交为处理持续时间24、48、72 h。继续培养至蒴果开裂、吐絮时，套袋、收取种子，点播于经高温灭菌的土中，适时移入营养钵，待其继续长至25 cm高时移栽大田。
1.2.3 流式细胞术检测子代倍性。利用流式细胞仪检测山杨杂种子代倍性，具体方法如下，取约2 cm×2 cm生长正常的展开叶片置于培养皿里，加入2 ml 4 ℃预处理的提取缓冲液[1 000 ml为例，10 mmol/L MgSO4·7H2O 2.46 g，50 mmol/L KCl 3.727 5 g，5 mmol/L HEPES 1.191 5 g，1%（W/V） PVP-40 10 g，0.25%（V/V） Triton X-100 2.5 ml，pH=8.0]，用锋利的刀片快速将其切碎；叶片组织捣碎液用30 μm滤网过滤至上样管中，收集的滤液中加入1 ml Staining solution（Partec）染液，充分混匀后染色5 min；采用Partec CyFlow-PA型流式细胞仪对样品进行染色体倍性检测。
2 结果与分析
以山杨、中美山杨为母本，山杨、新疆杨为父本进行杂交，切枝水培杂交与树上杂交授粉后施加秋水仙碱处理，都获得了三倍體与四倍体。
2.1授粉后施加秋水仙碱处理诱导多倍体
2.1.1 切枝水培杂交。以优良种源山杨为母本，新疆杨为父本，授粉后，利用不同浓度秋水仙碱浸泡山杨雌花序，诱导山杨杂种三倍体或四倍体。倍性检测结果表明，有2个处理组合获得三倍体，共4株，有1个处理组合获得四倍体2株。其中，授粉48 h后，以0.3%浓度的秋水仙碱浸泡山杨雌花序，处理持续24 h，保留2年生杂种子代苗6株，其中三倍体2株，诱导比例达33.3%（表1），另外，授粉72 h后，以0.3%浓度的秋水仙碱浸泡山杨雌花序，处理持续24 h，保留2年生杂种子代苗42株，其中三倍体1株，诱导比例为2.3%。授粉96 h后，以0.3%浓度的秋水仙碱浸泡山杨雌花序，处理持续24 h，保留2年生杂种子代苗11株，其中四倍体2株，诱导比例为18.2%。因此，授粉48 h后，以0.3%浓度的秋水仙碱浸泡山杨雌花序，持续24 h，诱导山杨产生3倍体效果最好，授粉96 h后，以0.3%浓度的秋水仙碱浸泡山杨雌花序，持续24 h，诱导山杨产生四倍体效果最好。 2.1.2 树上杂交。以中美山杨为母本，优良种源山杨为父本，授粉后，利用不同浓度秋水仙碱浸泡山杨雌花序，诱导山杨杂种三倍体或四倍体。倍性检测结果表明，有1个处理组合获得三倍体2株，有1个处理组合获得四倍体1株。授粉96 h后，以0.1%浓度的秋水仙碱浸泡山杨雌花序，处理持续48 h，保留2年生杂种子代苗75株，其中三倍体2株，诱导比例达2.7%（表2），另外，授粉120 h后，以0.1%浓度的秋水仙碱浸泡山杨雌花序，处理持续48 h，保留2年生杂种子代苗16株，其中四倍体1株，诱导比例为6.3%。因此，授粉96 h后，以0.1%浓度的秋水仙碱浸泡山杨雌花序，持续48 h，诱导山杨产生三倍体效果最好，授粉120 h后，以0.1%浓度的秋水仙碱浸泡山杨雌花序，持续48 h，诱导山杨产生四倍体效果最好。
2.2流式细胞术鉴定植株倍性采用Partec CyFlow-PA型流式细胞仪对样品进行染色体倍性检测。测试样品细胞核DNA的含量是以对照为标准的相对值（图1）。
参考文献
[1] 白卉.山杨遗传多样性研究与核心种质构建及利用[D].哈尔滨：东北林业大学，2010：1-2.
[2] EINSPAHR D W.美洲山杨遗传学[M].王瑞玲，译.哈尔滨：黑龙江科学技术出版社，1993：164-178.
[3] EINSPAHR D W. Production and utilization of triploid hybrid Aspen[J].Iowa State Journal of Research， 1984，58（4）：401-409.
[4] 李云，朱之悌，田砚亭，等.秋水仙碱处理白杨雌花芽培育三倍体植株的研究[J].林业科学，2001，37（5）：68-74.
[5] WEISGERBER H，RAU H M，GARTNER E J，et al. 25 years of forest tree breeding in Hessen[M].Allgemeing-Forstzeitschriff，1980：665-712.
[6] CAMPOS J M S， DAVIDE L C， SALGADO C C， et al. In vitro induction of hexaploid plants from triploid hybrids of Penntisetum purpureum and Pennisetum glaucum [J]. Plant Breed， 2009， 128：101-104.
[7] YI W， LAW E， MCCOY D，et al. Stigma development and receptivity in almond （Prunus dulcis） [J].Annals of Botany，2006， 97： 57-63.
[8] 朱之悌，康向陽，张志毅.毛白杨天然三倍体选种研究[J].林业科学，1998，34（4）：22-31.
[9] 王君，康向阳，李代丽，等.授粉后施加秋水仙碱处理诱导青杨异源三倍体[J].北京林业大学学报， 2007， 29（5）： 18-21.
[10] 康向阳.林木多倍体育种研究进展[J].北京林业大学学报，2003，25（4）：70-74.
[11] 王君，康向阳，刘立成，等.青杨派树种雌蕊柱头可授性及最佳授粉时期[J]. 北京林业大学学报，2009，31（4）：30-35.
关键词山杨；多倍体；秋水仙碱
中图分类号S792.11文献标识码A文章编号0517-6611（2014）04-01098-03
基金项目黑龙江省森工总局基础研究项目（sgzjY2013003、sgzjY2010012）；黑龙江省财政厅自拟项目（201204，201303）。
作者简介李静（1986-），女，山东临邑人，硕士研究生，研究方向：杨树倍性育种。*通讯作者，副教授，从事细胞活性物质利用研究。
山杨（Populus davidiana Dode.）属白杨派，又称中国山杨，在我国广泛分布，抗寒、耐旱，是撂荒地、采伐迹地和火烧迹地森林更新的先锋树种。山杨木材结构均匀、质轻而软、颜色淡白，纤维长、宽、长宽比和纤维素含量等均高于大青杨、香杨和小黑杨等，不用填充其他原料即可用于造纸[1]。山杨这些特性在短周期纸浆材等森林工业用材生产中具有明显优势[2-4]。近年来，随着经济的快速发展，我国对纸张的需求骤增，同时对纸张品质的要求也在不断提高。山杨作为优质纸浆原材，其可利用的天然林日渐减少，此时就需要营造大量人工林来填补天然林供应不足的空缺。
国内外有关倍性育种的实践证明，多倍体育种由于染色体倍数性增加，常常带来一些形态和生理上的变化，其在提高种子生长速度、增进遗传品质以及提高目的代谢物含量等方面具有优势，可以通过一轮次育种过程实现多目标性状遗传改良。杨树多倍体在材积生长量、木材品质以及抗性方面具有很大优势[5-8]。目前关于山杨的遗传改良主要集中于选优、杂交育种等方面，迄今未见有关山杨多倍体诱导成功的研究报道。该研究主要以山杨及其杂种为材料，对授粉后施加秋水仙碱溶液诱导山杨多倍体的技术条件进行了初步探索。
1 材料与方法
1.1 试验材料以山杨以及杂交品种中美山杨为母本，山杨和新疆杨为父本。其中山杨取自黑龙江省林口县青山林场山杨基因保存林，新疆杨取自阿克苏地区，中美山杨取自黑龙江省林业科学院院内保存林，是引进生长优异的美洲山杨花粉与优良种源的中国山杨进行地理远源杂交选育出的优良品种。
于2月上旬，收集杨树枝条，选择直径为1～2 cm，无病虫害、带有花芽的、健壮的枝条，将雌花枝剪成1.5～2.0 m长，雄花枝剪成1.0 m左右，用塑料薄膜将上述花枝包裹后带回哈尔滨，低温保存备用[9]。
1.2研究方法
1.2.1 杂交育种。杂交育种分为树上杂交与切枝水培杂交。树上杂交利用的是位于黑龙江省林业科学院院内的中美山杨保存林。切枝水培杂交以山杨为母本。首先将选择好的雄花枝进行室内切枝水培，收集花粉，干燥，贮藏于4 ℃冰箱备用。观察雌花发育情况，到可授期时分别用上述花粉授粉[10-12]。
1.2.2 利用秋水仙碱诱导加倍。授粉后施加秋水仙碱处理诱导加倍，自授粉48 h后，对雌花序进行秋水仙碱诱导处理，处理方式为瓶浸法，秋水仙碱溶液浓度为0.1%、0.3%、0.5%，切枝杂交为处理持续时间24、36、48 h，树上杂交为处理持续时间24、48、72 h。继续培养至蒴果开裂、吐絮时，套袋、收取种子，点播于经高温灭菌的土中，适时移入营养钵，待其继续长至25 cm高时移栽大田。
1.2.3 流式细胞术检测子代倍性。利用流式细胞仪检测山杨杂种子代倍性，具体方法如下，取约2 cm×2 cm生长正常的展开叶片置于培养皿里，加入2 ml 4 ℃预处理的提取缓冲液[1 000 ml为例，10 mmol/L MgSO4·7H2O 2.46 g，50 mmol/L KCl 3.727 5 g，5 mmol/L HEPES 1.191 5 g，1%（W/V） PVP-40 10 g，0.25%（V/V） Triton X-100 2.5 ml，pH=8.0]，用锋利的刀片快速将其切碎；叶片组织捣碎液用30 μm滤网过滤至上样管中，收集的滤液中加入1 ml Staining solution（Partec）染液，充分混匀后染色5 min；采用Partec CyFlow-PA型流式细胞仪对样品进行染色体倍性检测。
2 结果与分析
以山杨、中美山杨为母本，山杨、新疆杨为父本进行杂交，切枝水培杂交与树上杂交授粉后施加秋水仙碱处理，都获得了三倍體与四倍体。
2.1授粉后施加秋水仙碱处理诱导多倍体
2.1.1 切枝水培杂交。以优良种源山杨为母本，新疆杨为父本，授粉后，利用不同浓度秋水仙碱浸泡山杨雌花序，诱导山杨杂种三倍体或四倍体。倍性检测结果表明，有2个处理组合获得三倍体，共4株，有1个处理组合获得四倍体2株。其中，授粉48 h后，以0.3%浓度的秋水仙碱浸泡山杨雌花序，处理持续24 h，保留2年生杂种子代苗6株，其中三倍体2株，诱导比例达33.3%（表1），另外，授粉72 h后，以0.3%浓度的秋水仙碱浸泡山杨雌花序，处理持续24 h，保留2年生杂种子代苗42株，其中三倍体1株，诱导比例为2.3%。授粉96 h后，以0.3%浓度的秋水仙碱浸泡山杨雌花序，处理持续24 h，保留2年生杂种子代苗11株，其中四倍体2株，诱导比例为18.2%。因此，授粉48 h后，以0.3%浓度的秋水仙碱浸泡山杨雌花序，持续24 h，诱导山杨产生3倍体效果最好，授粉96 h后，以0.3%浓度的秋水仙碱浸泡山杨雌花序，持续24 h，诱导山杨产生四倍体效果最好。 2.1.2 树上杂交。以中美山杨为母本，优良种源山杨为父本，授粉后，利用不同浓度秋水仙碱浸泡山杨雌花序，诱导山杨杂种三倍体或四倍体。倍性检测结果表明，有1个处理组合获得三倍体2株，有1个处理组合获得四倍体1株。授粉96 h后，以0.1%浓度的秋水仙碱浸泡山杨雌花序，处理持续48 h，保留2年生杂种子代苗75株，其中三倍体2株，诱导比例达2.7%（表2），另外，授粉120 h后，以0.1%浓度的秋水仙碱浸泡山杨雌花序，处理持续48 h，保留2年生杂种子代苗16株，其中四倍体1株，诱导比例为6.3%。因此，授粉96 h后，以0.1%浓度的秋水仙碱浸泡山杨雌花序，持续48 h，诱导山杨产生三倍体效果最好，授粉120 h后，以0.1%浓度的秋水仙碱浸泡山杨雌花序，持续48 h，诱导山杨产生四倍体效果最好。
2.2流式细胞术鉴定植株倍性采用Partec CyFlow-PA型流式细胞仪对样品进行染色体倍性检测。测试样品细胞核DNA的含量是以对照为标准的相对值（图1）。
参考文献
[1] 白卉.山杨遗传多样性研究与核心种质构建及利用[D].哈尔滨：东北林业大学，2010：1-2.
[2] EINSPAHR D W.美洲山杨遗传学[M].王瑞玲，译.哈尔滨：黑龙江科学技术出版社，1993：164-178.
[3] EINSPAHR D W. Production and utilization of triploid hybrid Aspen[J].Iowa State Journal of Research， 1984，58（4）：401-409.
[4] 李云，朱之悌，田砚亭，等.秋水仙碱处理白杨雌花芽培育三倍体植株的研究[J].林业科学，2001，37（5）：68-74.
[5] WEISGERBER H，RAU H M，GARTNER E J，et al. 25 years of forest tree breeding in Hessen[M].Allgemeing-Forstzeitschriff，1980：665-712.
[6] CAMPOS J M S， DAVIDE L C， SALGADO C C， et al. In vitro induction of hexaploid plants from triploid hybrids of Penntisetum purpureum and Pennisetum glaucum [J]. Plant Breed， 2009， 128：101-104.
[7] YI W， LAW E， MCCOY D，et al. Stigma development and receptivity in almond （Prunus dulcis） [J].Annals of Botany，2006， 97： 57-63.
[8] 朱之悌，康向陽，张志毅.毛白杨天然三倍体选种研究[J].林业科学，1998，34（4）：22-31.
[9] 王君，康向阳，李代丽，等.授粉后施加秋水仙碱处理诱导青杨异源三倍体[J].北京林业大学学报， 2007， 29（5）： 18-21.
[10] 康向阳.林木多倍体育种研究进展[J].北京林业大学学报，2003，25（4）：70-74.
[11] 王君，康向阳，刘立成，等.青杨派树种雌蕊柱头可授性及最佳授粉时期[J]. 北京林业大学学报，2009，31（4）：30-35.