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摘要：目的：通过黄连素液对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌株进行的体外抑菌试验，观察黄连素液的抑菌效果，并以电镜观察细菌超微结构的改变。方法：用医院自制的黄连素液对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌株进行处理后，用电镜观察细菌超微结构的改变。结果：电镜下，经黄连素液处理的耐药菌株菌体分散，部分菌体固缩死亡，而陰性对照组表现为细菌菌体聚集成团，表面光滑，细胞结构完整、胞质均匀，可见有丝分裂。结论：黄连素液对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌株有较强的抑菌效果。
关键词：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌;黄连素;透射电镜
本研究用黄连素液对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌株进行体外试验，并采取电镜来进一步监测细菌自身超微特征的变化情况，来观察黄连素液的抑菌效果，现报道如下：
1材料与方法
1.1 材料
1.1.1 黄连素液
5%黄连素液为医院长期临床使用的院内制剂，250 g黄连中药药材粉碎加水浸泡2 h，强火加热至沸，再以文火煎煮至5 000 ml原液，即0.05 g/ml的中药原液，高压灭菌后置4℃冰箱保存备用，保质期1个月。
1.1.2 试验菌株
分离自医院耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染患者的伤口分泌物，经Vitek-2 Compact（购自BIOMERIELIX公司）鉴定并经平板生长观察证实为产生物膜的MRSA菌株。将保存的试验菌株接种于5%血平板，置37℃（ gSP‐9270MBE 隔水式恒温培养箱，购自上海博迅实业有限公司医疗设备厂）培养24 h，连续转种培养3次。选定质控菌株ST-239，-80℃冰箱中保存备用。
1.2 研究方法
1.2.1 菌悬液制备
菌种复苏，挑取菌落至3%胰蛋白胨大豆肉汤（Trypticase Soybroth， TBS）液体培养基中，1 30 r/min，37℃匀速振荡培养过夜，再以1：100比例重新接种至新的TBS中，1 30 r/min，37℃匀速振荡培养195 min至对数生长期。取菌液离心，6 000 r/min，15 min，用无菌PBS冲洗两遍，然后混悬至×109 CFU/ml。
1.2.2 电镜样品制备
取约1×107 ml的菌悬液涂布于0.05 g/ml黄连素液的平板表面，置于37℃培养24 h后收集平板上的菌体。用PBS洗涤菌体沉淀3次后，将得到的菌体滴到载玻片上，制成菌悬液涂片。放入电镜扫描使用的2.5%戊二醛磷酸缓冲液中保持稳定3 h;0.1M PBS缓冲液冲洗2次，每次时限为15 min;加入1%锇酸后固定1 h;0.1M PBS冲洗15min×2次;2%醋酸铀水溶液染色30 min;50%、70%、90%酒精依次脱水，各15 min×1次;100%酒精脱水20 min×1次;100%丙酮脱水20 min×2次;1：1渗透：无水丙酮与包埋剂按1：1体积混合渗透菌体，并震荡2 h;纯包埋剂渗透菌体，并震荡2 h;纯包埋剂包埋，并置于烘箱内聚合，37℃聚合24 h，45℃聚合24 h，60℃聚合48 h;染色：4%醋酸铀染色20 min，枸橼酸铅染色5 min;将染色后的涂片拍照要求以单孔铜网进行固定，利用电镜透射进行拍照观察和记录。对照组进行空白的菌体，操作步骤相似，可参照实现。
2结果
两组MRSA菌株在电镜下的形态 空白菌体对照组（不加黄连素液的菌悬液）MRSA菌株菌体透亮，无固缩，聚集成团，偶见正在分裂的菌体。加黄连素液的菌悬液MRSA菌株菌体固缩，不成团。
3讨论
黄连作为多年生草本植物，主要来源有三种，分别是毛莨科植物黄连、三角叶黄连或云连，取上述三种中药晒干得根茎即可，主要成份以小蘖碱为主（超过3.6%）[1～2]。黄连在中药领域以清热燥湿、泻火解毒为主，但是该药的抗菌谱也较广，可以对多种细菌产生敏感抗菌作用[3～4]，如金黄色葡萄球菌等，研究发现对至少高达9种以上的真菌有效果。本研究结果显示，在形态学上正常的MRSA菌株菌体透亮，无固缩，聚集成团，偶见正在分裂的菌体，增殖活跃;而经黄连素液作用后MRSA菌株形态学上发生明显改变，出现菌体固缩，不成团，增殖明显受到抑制，并出现菌体死亡。从而证实：黄连素液确实对MRSA具有抑制作用。
通过电镜观察得出黄连素对MRSA有较好的抑菌作用，但具体在何环节发挥药理作用及其具体的抑菌作用情况尚未确定，需要深入探讨，提升中草药抑菌的现代病理学理论研究水平。
参考文献
[1]中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京：人民卫生出版社，化学工业出版社，1990.275-276.
[2]王维琪.黄连有效成分的药理研究与进展[J].中医临床研究，2016，8（26）：147-148.
[3]姚冬婷，胡骏，张雪清，等.黄连对金黄色葡萄球菌体外抑菌活性的分析[J].检验医学，2017，32（7）：577-581.
[4]谢川东，文燕，曾昱伟，等.黄连抗菌活性成分研究[J].湖北农业科学，2018，57（23）：85-88.
关键词：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌;黄连素;透射电镜
本研究用黄连素液对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌株进行体外试验，并采取电镜来进一步监测细菌自身超微特征的变化情况，来观察黄连素液的抑菌效果，现报道如下：
1材料与方法
1.1 材料
1.1.1 黄连素液
5%黄连素液为医院长期临床使用的院内制剂，250 g黄连中药药材粉碎加水浸泡2 h，强火加热至沸，再以文火煎煮至5 000 ml原液，即0.05 g/ml的中药原液，高压灭菌后置4℃冰箱保存备用，保质期1个月。
1.1.2 试验菌株
分离自医院耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染患者的伤口分泌物，经Vitek-2 Compact（购自BIOMERIELIX公司）鉴定并经平板生长观察证实为产生物膜的MRSA菌株。将保存的试验菌株接种于5%血平板，置37℃（ gSP‐9270MBE 隔水式恒温培养箱，购自上海博迅实业有限公司医疗设备厂）培养24 h，连续转种培养3次。选定质控菌株ST-239，-80℃冰箱中保存备用。
1.2 研究方法
1.2.1 菌悬液制备
菌种复苏，挑取菌落至3%胰蛋白胨大豆肉汤（Trypticase Soybroth， TBS）液体培养基中，1 30 r/min，37℃匀速振荡培养过夜，再以1：100比例重新接种至新的TBS中，1 30 r/min，37℃匀速振荡培养195 min至对数生长期。取菌液离心，6 000 r/min，15 min，用无菌PBS冲洗两遍，然后混悬至×109 CFU/ml。
1.2.2 电镜样品制备
取约1×107 ml的菌悬液涂布于0.05 g/ml黄连素液的平板表面，置于37℃培养24 h后收集平板上的菌体。用PBS洗涤菌体沉淀3次后，将得到的菌体滴到载玻片上，制成菌悬液涂片。放入电镜扫描使用的2.5%戊二醛磷酸缓冲液中保持稳定3 h;0.1M PBS缓冲液冲洗2次，每次时限为15 min;加入1%锇酸后固定1 h;0.1M PBS冲洗15min×2次;2%醋酸铀水溶液染色30 min;50%、70%、90%酒精依次脱水，各15 min×1次;100%酒精脱水20 min×1次;100%丙酮脱水20 min×2次;1：1渗透：无水丙酮与包埋剂按1：1体积混合渗透菌体，并震荡2 h;纯包埋剂渗透菌体，并震荡2 h;纯包埋剂包埋，并置于烘箱内聚合，37℃聚合24 h，45℃聚合24 h，60℃聚合48 h;染色：4%醋酸铀染色20 min，枸橼酸铅染色5 min;将染色后的涂片拍照要求以单孔铜网进行固定，利用电镜透射进行拍照观察和记录。对照组进行空白的菌体，操作步骤相似，可参照实现。
2结果
两组MRSA菌株在电镜下的形态 空白菌体对照组（不加黄连素液的菌悬液）MRSA菌株菌体透亮，无固缩，聚集成团，偶见正在分裂的菌体。加黄连素液的菌悬液MRSA菌株菌体固缩，不成团。
3讨论
黄连作为多年生草本植物，主要来源有三种，分别是毛莨科植物黄连、三角叶黄连或云连，取上述三种中药晒干得根茎即可，主要成份以小蘖碱为主（超过3.6%）[1～2]。黄连在中药领域以清热燥湿、泻火解毒为主，但是该药的抗菌谱也较广，可以对多种细菌产生敏感抗菌作用[3～4]，如金黄色葡萄球菌等，研究发现对至少高达9种以上的真菌有效果。本研究结果显示，在形态学上正常的MRSA菌株菌体透亮，无固缩，聚集成团，偶见正在分裂的菌体，增殖活跃;而经黄连素液作用后MRSA菌株形态学上发生明显改变，出现菌体固缩，不成团，增殖明显受到抑制，并出现菌体死亡。从而证实：黄连素液确实对MRSA具有抑制作用。
通过电镜观察得出黄连素对MRSA有较好的抑菌作用，但具体在何环节发挥药理作用及其具体的抑菌作用情况尚未确定，需要深入探讨，提升中草药抑菌的现代病理学理论研究水平。
参考文献
[1]中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京：人民卫生出版社，化学工业出版社，1990.275-276.
[2]王维琪.黄连有效成分的药理研究与进展[J].中医临床研究，2016，8（26）：147-148.
[3]姚冬婷，胡骏，张雪清，等.黄连对金黄色葡萄球菌体外抑菌活性的分析[J].检验医学，2017，32（7）：577-581.
[4]谢川东，文燕，曾昱伟，等.黄连抗菌活性成分研究[J].湖北农业科学，2018，57（23）：85-88.