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摘要：用胃蛋白酶对鲤鱼鱼肉进行水解，并在单因素试验的基础上选取酶浓度、pH值、反应温度、反应时间作为影响蛋白提取率的因素。根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，采用4因素3水平响应面分析法对鲤鱼多肽的提取工艺进行优化研究，确定胃蛋白酶提取鲤鱼多肽时的最佳工艺参数。结果表明，胃蛋白酶酶解的最佳条件为酶质量浓度17.77 mg/mL、溫度36.65 ℃、时间3.7 h、pH值1.07，在该条件下多肽提取质量浓度为1.97 mg/mL。
关键词：鲤鱼；胰蛋白酶；多肽；响应面法
中图分类号： TS254.1文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2017）03-0151-04
[HJ1.4mm]
收稿日期：2015-12-17
基金项目：河南省教育厅科学技术研究重点项目（编号：13A180044）。
作者简介：张红波（1982—），男，河南遂平人，硕士，讲师，主要从事生物工程研究。E-mail：[email protected]。[HJ]
鲤鱼属鱼纲鲤科，是淡水鱼类中品种最多、分布最广、养殖历史最悠久、产量最高的品种之一。从消费品种上看，我国水产品中鱼类消费占50%以上；在消费的鱼类产品中，消费总量超过200万t的鱼类有草鱼、鳙鱼、鲢鱼、鲫鱼、鲤鱼，这5类鱼占淡水鱼消费总量的70%以上。鲤鱼味道鲜美，深受广大消费者的喜爱，其鱼肉中蛋白质含量高，质量极佳，易被人体消化吸收。蛋白质在人体内由蛋白酶水解成小肽进行吸收。研究发现，多肽比氨基酸更易被人体吸收利用，且多肽具有多种生物学作用。某些多肽能够清除生物体内过量的游离基、自由基等，抑制脂质过氧化的发生，保护细胞及其细胞器的正常生理结构和功能[1]。有些多肽还具有抗疲劳、耐缺氧、抗肿瘤的生物学作用[2-6]。此外，有些多肽具有免疫调节[7]、抗菌[8]、舒张血管的作用[9]。然而，我国对鱼类的加工技术还不是特别成熟，水产养殖与相关食品加工行业的生产效益并不高，且加工形式比较单调。本研究根据鲤鱼多肽的性质，利用酶解法提取鲤鱼多肽，并在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，采用响应面分析法对酶解法制备鲤鱼多肽的工艺进行优化研究，以期得到合理的提取工艺，提高鲤鱼多肽的提取率，为探究鲤鱼的附加价值和工业化生产奠定理论基础和科学依据。
1材料与方法
1.1材料与仪器
鲜活鲤鱼，购自当地市场。胃蛋白酶、Tris-碱，均购自上海百赛生物技术有限公司；双缩脲A、B，购自上海振品化工有限公司。其他试剂均为分析纯。
主要仪器：B1312511型超纯水仪，HWS28型电子恒温水浴锅（上海一恒科技仪器有限公司），101-1SA型定时恒温鼓风干燥箱（金坛市盛蓝仪器制造有限公司），FE20型实验室pH计，ME204E型电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司），EnSpireTM型酶标仪（铂金埃尔默仪器[上海]有限公司），WND型二两装高速中药粉碎机（浙江省兰溪市伟能达电器有限公司）。
1.2多肽的提取与测定
取新鲜鲤鱼，去除鳞片和内脏等器官，洗净。选取鱼腹肉，称质量后蒸熟，按1 ∶[KG-*3]3的质量比添加调好pH值的Tris-HCl缓冲液，用绞碎机绞碎；取0.5 mL鱼浆，按1 ∶[KG-*3]2的体积比添加一定浓度的蛋白酶液，在恒温水浴锅中进行水浴，之后用 100 ℃ 沸水灭酶活处理10 min，以4 000 r/min离心 15 min；取上清，按1 ∶[KG-*3]1的体积比添加10%三氯乙酸（TCA），充分混匀后静置 10 min，以4 000 r/min离心15 min；取上清，与5% TCA按 1 ∶[KG-*3]9 的体积比充分混合，静置10 min；取 120 mL 上述溶液，按 3 ∶[KG-*3]2 的体积比与双缩脲试剂混合（以5% TCA作为空白对照），静置10 min，以2 000 r/min离心 10 min；取上清，置于96孔板中，于540 nm測定吸光度[11]。
1.3标准曲线的绘制
配置4 mg/mL的四肽甘氨酸-甘氨酸-酪氨酸-精氨酸（Gly-Gly-Tyr-Arg）溶液，用5% TCA进行稀释，分别稀释至3.500、3.000、2.500、2.000、1.500、1.000、0.500、0.250、0.125 mg/mL。取不同稀释程度的四肽溶液（包括4 mg/mL）120 mL，按3 ∶[KG-*3]2的体积比添加双缩脲试剂，静置10 min使之[LM]充分反应；以2 000 r/min离心 10 min，取上清置于96孔板中，于540 nm测定吸光度，根据所得D540 nm绘制标准曲线。
1.4单因素试验
单因素水平如下：胃蛋白酶质量浓度分别为1、2、3、4、5、10、15、20、25 mg/mL，pH值分别为 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、30，温度分别为30、35、40、45、50、55、60 ℃，时间分别为2、3、4、5、6、7 h。
1.5酶解制备多肽响应面优化设计
在单因素试验的基础上，按照Box-Behnken中心组合试验设计原理，以酶解温度、时间、酶质量浓度、pH值为自变量，以D540 nm为响应值，自变量的高、中、低水平分别用1、0、-1编码值表示（表1）。
2结果与分析
2.1胃蛋白酶处理的单因素试验结果
pH值1.5、反应时间4 h、反应温度40 ℃时，测定不同酶质量浓度对多肽提取的影响。图1-A结果显示，当酶质量浓度小于15 mg/mL时，D540 nm随着酶质量浓度的增大而增大；当酶质量浓度为15 mg/mL时，D540 nm达最大值。选择 15 mg/mL 作为反应的最佳酶质量浓度。 pH值1.5、反应温度40 ℃、酶质量浓度15 mg/mL时，以酶解时间为自变量，测定酶解时间对多肽提取的影响。结果显示，当酶解时间低于4 h时，D540 nm随着温度的升高而提高；当酶解时间为4 h时，D540 nm有最大值（图1-B）。選择4 h作为反应的最佳酶解时间。
pH值1.5、反应时间4 h、酶质量浓度15 mg/mL时，以酶解温度为变量，测定酶解温度对多肽提取的影响。结果显示，当温度低于40 ℃时，D540 nm随着温度的升高而提高；当温度为40 ℃时，D540 nm有最大值（图1-C）。选择40 ℃作为反应的最佳酶解温度。
酶质量浓度15 mg/mL、反应时间4 h、反应温度40 ℃时，以pH值为变量，测定pH值对多肽提取的影响。结果显示，当pH值小于1.0时，D540 nm随着pH值的增大而提高；当pH值为1.0时，D540 nm有最大值（图1-D）。选择1.0作为反应的最佳pH值。
2.2响应面分析胃蛋白酶水解效果
根据单因素试验结果，选择酶解温度、酶解时间、酶质量浓度、pH值作为4个因素，以D540 nm为响应值，设计4因素3水平的响应面试验。根据Box-Behnken试验设计进行了27组试验，其中1～24组为分析试验和零点试验，25～27组为中心点重复试验，试验组合见表2。
采用Design-Expert 8.0.6.1软件对D540 nm与各水解因[JP2]素进行多元回归拟合，得到回归方程：D540 nm=0.085 7.250×[JP3]10-4×A-8.917×10-4×B 3.525×10-3×C 4.958×10-3×[JP]D 2.425×10-3×A×B-2.250×10-3×A×C-3350×10-3×A×D-1.700×10-3×B×C-2.750×10-3×B×D-[JP2]2.325×10-3×C×D-2.454×10-3×A2-4.979×10-3×B2-[JP]4.079×10-3×C2-0.022×D2。
方差分析结果（表3）显示，试验中一次项C（酶质量浓度）、D（pH值）及时间、酶质量浓度、pH值的二次项影响较为显著，在试验范围内模型的“P值>F值”<0.000 1，表明该二次多项式回归方程模型达到了极显著水平，具有较高的可靠性；R2=0.946 8，表明试验值与预测值高度相关，即相应[JP2]值的变化有94.68%来自所选变量；同时变异系数（CV）=[JP]561%，且失拟项不显著（P=0.069 7>0.05），表明实际值与模型预测值有较好的拟合度。可见，试验所建立的数学回归模型拟合度高，可较好地反映各因素与响应值间的真实关系，因[CM（25]此采用该数学模型预测胃蛋白酶提取鲤鱼多肽的提取条件。
各因素对D540 nm的影响不是简单的线性关系，其影响效果由F值可得，4个因素对响应值的影响大小依次为D（pH值）>C（酶质量浓度）>B（时间）>A（温度）。
利用二次多项式回归方程和Design-Expert 8.0.6.1[JP2]软件作图分析（图2）。所得回归方程为D540 nm=0.085 7.250×[JP]10-4×A-8.917×10-4×B 3.525×10-3×C 4.958×10-3×D 2.425×10-3×A×B-2.250×10-3×A×C-3350×10-3×A×D-1.700×10-3×B×C-2.750×10-3×B×D-2.325×10-3×C×D-2.454×10-3×A2-4.979×10-3×B2-4.079×10-3×C2-0.022×D2。
对上述回归方程求解，可得A=36.65、B=3.70、C=1777、D=1.07，D540 nm有最大值0.086 1。对照标准曲线即可得到当前体系下多肽的质量浓度为1.97 mg/mL，即胃蛋白酶酶解鲤鱼多肽的最佳条件组合为温度36.65 ℃、时间 3.7 h、酶质量浓度17.77 mg/mL、pH值1.07，此时D540 nm为 0.086 1。为验证模型预测的准确性，于温度36.7 ℃、时间37 h、加酶量17.74 mg/mL、pH值1.06条件下进行试验，实际测得D540 nm为0.086 3。实测值与理论值的误差在±1%左右，可见此模型能较好地预测酶水解的最佳条件，预测条件可作为最佳水解条件。
[BT1-*5]3结论与讨论
3.1酶质量浓度对酶解结果的影响
当酶用量过少时，底物浓度远远大于酶浓度，反应系统中酶促反应速度与酶浓度成正比，随着酶用量的增大，酶解液中蛋白质、多肽与酶作用的机会大大增加，分解为游离氨基酸[10]。酶分子过量时，很多酶分子根本不能发挥作用，水解度相对降低，造成不必要的浪费。本试验中，当酶质量浓度为15 mg/mL时反应效果最佳。响应面分析表明，酶质量浓度对胃蛋白酶的提取效果影响较大。
3.2pH值对反应结果的影响
酶分子是一种特殊的蛋白质分子，具有若干个活性部位，酶的活性部位由结合位点和催化位点组成。结合部位和催化部位对反应体系的pH值变化比较敏感，其解离状态随pH值的变化而变化，这些变化影响了酶分子的特殊构象。pH值的变化直接影响了酶与底物的结合和催化，是酶催化反应的主要因素之一[11]。胃蛋白酶的最適pH值范围约为1.0～2.0，试验测得最佳pH值为1.06，符合胃蛋白酶的反应要求。响应面综合分析各因素表明，pH值对胃蛋白酶的影响较大。
3.3反应温度对反应结果的影响
温度对酶活力的影响较大[12-13]。温度较低时，酶活力受到抑制；随着温度的升高，加速水解反应处于主导地位，达到最适温度后，酶失活处于主导地位，酶活随温度的升高而下降[14]。因此，本研究选取反应温度为36.65 ℃。响应面分析表明，温度对胃蛋白酶的影响较小。 3.4反应时间对反应结果的影响
随着酶解时间的延长，多肽被继续水解成氨基酸[15]，当反应时间为4 h时，D540 nm达到最大值，可作為最佳的提取条件。达到最适时间后出现了下降趋势，可能是由于水解过于充分，导致水解产生了单个氨基酸，在双缩脲反应中无法产生颜色反应。
3.5结论
通过单因素试验和响应面试验，得到了胃蛋白酶处理的最佳条件为温度36.65 ℃、时间3.7 h、酶质量浓度 17.77 mg/mL、pH值1.07，此体系下的多肽提取质量浓度为1.97 mg/mL。本研究表明，基于响应面法分析所得的优化胃蛋白酶酶解提取鲤鱼多肽的工艺参数准确可靠，具有实用价值。
[HS2]参考文献：
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关键词：鲤鱼；胰蛋白酶；多肽；响应面法
中图分类号： TS254.1文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2017）03-0151-04
[HJ1.4mm]
收稿日期：2015-12-17
基金项目：河南省教育厅科学技术研究重点项目（编号：13A180044）。
作者简介：张红波（1982—），男，河南遂平人，硕士，讲师，主要从事生物工程研究。E-mail：[email protected]。[HJ]
鲤鱼属鱼纲鲤科，是淡水鱼类中品种最多、分布最广、养殖历史最悠久、产量最高的品种之一。从消费品种上看，我国水产品中鱼类消费占50%以上；在消费的鱼类产品中，消费总量超过200万t的鱼类有草鱼、鳙鱼、鲢鱼、鲫鱼、鲤鱼，这5类鱼占淡水鱼消费总量的70%以上。鲤鱼味道鲜美，深受广大消费者的喜爱，其鱼肉中蛋白质含量高，质量极佳，易被人体消化吸收。蛋白质在人体内由蛋白酶水解成小肽进行吸收。研究发现，多肽比氨基酸更易被人体吸收利用，且多肽具有多种生物学作用。某些多肽能够清除生物体内过量的游离基、自由基等，抑制脂质过氧化的发生，保护细胞及其细胞器的正常生理结构和功能[1]。有些多肽还具有抗疲劳、耐缺氧、抗肿瘤的生物学作用[2-6]。此外，有些多肽具有免疫调节[7]、抗菌[8]、舒张血管的作用[9]。然而，我国对鱼类的加工技术还不是特别成熟，水产养殖与相关食品加工行业的生产效益并不高，且加工形式比较单调。本研究根据鲤鱼多肽的性质，利用酶解法提取鲤鱼多肽，并在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，采用响应面分析法对酶解法制备鲤鱼多肽的工艺进行优化研究，以期得到合理的提取工艺，提高鲤鱼多肽的提取率，为探究鲤鱼的附加价值和工业化生产奠定理论基础和科学依据。
1材料与方法
1.1材料与仪器
鲜活鲤鱼，购自当地市场。胃蛋白酶、Tris-碱，均购自上海百赛生物技术有限公司；双缩脲A、B，购自上海振品化工有限公司。其他试剂均为分析纯。
主要仪器：B1312511型超纯水仪，HWS28型电子恒温水浴锅（上海一恒科技仪器有限公司），101-1SA型定时恒温鼓风干燥箱（金坛市盛蓝仪器制造有限公司），FE20型实验室pH计，ME204E型电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司），EnSpireTM型酶标仪（铂金埃尔默仪器[上海]有限公司），WND型二两装高速中药粉碎机（浙江省兰溪市伟能达电器有限公司）。
1.2多肽的提取与测定
取新鲜鲤鱼，去除鳞片和内脏等器官，洗净。选取鱼腹肉，称质量后蒸熟，按1 ∶[KG-*3]3的质量比添加调好pH值的Tris-HCl缓冲液，用绞碎机绞碎；取0.5 mL鱼浆，按1 ∶[KG-*3]2的体积比添加一定浓度的蛋白酶液，在恒温水浴锅中进行水浴，之后用 100 ℃ 沸水灭酶活处理10 min，以4 000 r/min离心 15 min；取上清，按1 ∶[KG-*3]1的体积比添加10%三氯乙酸（TCA），充分混匀后静置 10 min，以4 000 r/min离心15 min；取上清，与5% TCA按 1 ∶[KG-*3]9 的体积比充分混合，静置10 min；取 120 mL 上述溶液，按 3 ∶[KG-*3]2 的体积比与双缩脲试剂混合（以5% TCA作为空白对照），静置10 min，以2 000 r/min离心 10 min；取上清，置于96孔板中，于540 nm測定吸光度[11]。
1.3标准曲线的绘制
配置4 mg/mL的四肽甘氨酸-甘氨酸-酪氨酸-精氨酸（Gly-Gly-Tyr-Arg）溶液，用5% TCA进行稀释，分别稀释至3.500、3.000、2.500、2.000、1.500、1.000、0.500、0.250、0.125 mg/mL。取不同稀释程度的四肽溶液（包括4 mg/mL）120 mL，按3 ∶[KG-*3]2的体积比添加双缩脲试剂，静置10 min使之[LM]充分反应；以2 000 r/min离心 10 min，取上清置于96孔板中，于540 nm测定吸光度，根据所得D540 nm绘制标准曲线。
1.4单因素试验
单因素水平如下：胃蛋白酶质量浓度分别为1、2、3、4、5、10、15、20、25 mg/mL，pH值分别为 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、30，温度分别为30、35、40、45、50、55、60 ℃，时间分别为2、3、4、5、6、7 h。
1.5酶解制备多肽响应面优化设计
在单因素试验的基础上，按照Box-Behnken中心组合试验设计原理，以酶解温度、时间、酶质量浓度、pH值为自变量，以D540 nm为响应值，自变量的高、中、低水平分别用1、0、-1编码值表示（表1）。
2结果与分析
2.1胃蛋白酶处理的单因素试验结果
pH值1.5、反应时间4 h、反应温度40 ℃时，测定不同酶质量浓度对多肽提取的影响。图1-A结果显示，当酶质量浓度小于15 mg/mL时，D540 nm随着酶质量浓度的增大而增大；当酶质量浓度为15 mg/mL时，D540 nm达最大值。选择 15 mg/mL 作为反应的最佳酶质量浓度。 pH值1.5、反应温度40 ℃、酶质量浓度15 mg/mL时，以酶解时间为自变量，测定酶解时间对多肽提取的影响。结果显示，当酶解时间低于4 h时，D540 nm随着温度的升高而提高；当酶解时间为4 h时，D540 nm有最大值（图1-B）。選择4 h作为反应的最佳酶解时间。
pH值1.5、反应时间4 h、酶质量浓度15 mg/mL时，以酶解温度为变量，测定酶解温度对多肽提取的影响。结果显示，当温度低于40 ℃时，D540 nm随着温度的升高而提高；当温度为40 ℃时，D540 nm有最大值（图1-C）。选择40 ℃作为反应的最佳酶解温度。
酶质量浓度15 mg/mL、反应时间4 h、反应温度40 ℃时，以pH值为变量，测定pH值对多肽提取的影响。结果显示，当pH值小于1.0时，D540 nm随着pH值的增大而提高；当pH值为1.0时，D540 nm有最大值（图1-D）。选择1.0作为反应的最佳pH值。
2.2响应面分析胃蛋白酶水解效果
根据单因素试验结果，选择酶解温度、酶解时间、酶质量浓度、pH值作为4个因素，以D540 nm为响应值，设计4因素3水平的响应面试验。根据Box-Behnken试验设计进行了27组试验，其中1～24组为分析试验和零点试验，25～27组为中心点重复试验，试验组合见表2。
采用Design-Expert 8.0.6.1软件对D540 nm与各水解因[JP2]素进行多元回归拟合，得到回归方程：D540 nm=0.085 7.250×[JP3]10-4×A-8.917×10-4×B 3.525×10-3×C 4.958×10-3×[JP]D 2.425×10-3×A×B-2.250×10-3×A×C-3350×10-3×A×D-1.700×10-3×B×C-2.750×10-3×B×D-[JP2]2.325×10-3×C×D-2.454×10-3×A2-4.979×10-3×B2-[JP]4.079×10-3×C2-0.022×D2。
方差分析结果（表3）显示，试验中一次项C（酶质量浓度）、D（pH值）及时间、酶质量浓度、pH值的二次项影响较为显著，在试验范围内模型的“P值>F值”<0.000 1，表明该二次多项式回归方程模型达到了极显著水平，具有较高的可靠性；R2=0.946 8，表明试验值与预测值高度相关，即相应[JP2]值的变化有94.68%来自所选变量；同时变异系数（CV）=[JP]561%，且失拟项不显著（P=0.069 7>0.05），表明实际值与模型预测值有较好的拟合度。可见，试验所建立的数学回归模型拟合度高，可较好地反映各因素与响应值间的真实关系，因[CM（25]此采用该数学模型预测胃蛋白酶提取鲤鱼多肽的提取条件。
各因素对D540 nm的影响不是简单的线性关系，其影响效果由F值可得，4个因素对响应值的影响大小依次为D（pH值）>C（酶质量浓度）>B（时间）>A（温度）。
利用二次多项式回归方程和Design-Expert 8.0.6.1[JP2]软件作图分析（图2）。所得回归方程为D540 nm=0.085 7.250×[JP]10-4×A-8.917×10-4×B 3.525×10-3×C 4.958×10-3×D 2.425×10-3×A×B-2.250×10-3×A×C-3350×10-3×A×D-1.700×10-3×B×C-2.750×10-3×B×D-2.325×10-3×C×D-2.454×10-3×A2-4.979×10-3×B2-4.079×10-3×C2-0.022×D2。
对上述回归方程求解，可得A=36.65、B=3.70、C=1777、D=1.07，D540 nm有最大值0.086 1。对照标准曲线即可得到当前体系下多肽的质量浓度为1.97 mg/mL，即胃蛋白酶酶解鲤鱼多肽的最佳条件组合为温度36.65 ℃、时间 3.7 h、酶质量浓度17.77 mg/mL、pH值1.07，此时D540 nm为 0.086 1。为验证模型预测的准确性，于温度36.7 ℃、时间37 h、加酶量17.74 mg/mL、pH值1.06条件下进行试验，实际测得D540 nm为0.086 3。实测值与理论值的误差在±1%左右，可见此模型能较好地预测酶水解的最佳条件，预测条件可作为最佳水解条件。
[BT1-*5]3结论与讨论
3.1酶质量浓度对酶解结果的影响
当酶用量过少时，底物浓度远远大于酶浓度，反应系统中酶促反应速度与酶浓度成正比，随着酶用量的增大，酶解液中蛋白质、多肽与酶作用的机会大大增加，分解为游离氨基酸[10]。酶分子过量时，很多酶分子根本不能发挥作用，水解度相对降低，造成不必要的浪费。本试验中，当酶质量浓度为15 mg/mL时反应效果最佳。响应面分析表明，酶质量浓度对胃蛋白酶的提取效果影响较大。
3.2pH值对反应结果的影响
酶分子是一种特殊的蛋白质分子，具有若干个活性部位，酶的活性部位由结合位点和催化位点组成。结合部位和催化部位对反应体系的pH值变化比较敏感，其解离状态随pH值的变化而变化，这些变化影响了酶分子的特殊构象。pH值的变化直接影响了酶与底物的结合和催化，是酶催化反应的主要因素之一[11]。胃蛋白酶的最適pH值范围约为1.0～2.0，试验测得最佳pH值为1.06，符合胃蛋白酶的反应要求。响应面综合分析各因素表明，pH值对胃蛋白酶的影响较大。
3.3反应温度对反应结果的影响
温度对酶活力的影响较大[12-13]。温度较低时，酶活力受到抑制；随着温度的升高，加速水解反应处于主导地位，达到最适温度后，酶失活处于主导地位，酶活随温度的升高而下降[14]。因此，本研究选取反应温度为36.65 ℃。响应面分析表明，温度对胃蛋白酶的影响较小。 3.4反应时间对反应结果的影响
随着酶解时间的延长，多肽被继续水解成氨基酸[15]，当反应时间为4 h时，D540 nm达到最大值，可作為最佳的提取条件。达到最适时间后出现了下降趋势，可能是由于水解过于充分，导致水解产生了单个氨基酸，在双缩脲反应中无法产生颜色反应。
3.5结论
通过单因素试验和响应面试验，得到了胃蛋白酶处理的最佳条件为温度36.65 ℃、时间3.7 h、酶质量浓度 17.77 mg/mL、pH值1.07，此体系下的多肽提取质量浓度为1.97 mg/mL。本研究表明，基于响应面法分析所得的优化胃蛋白酶酶解提取鲤鱼多肽的工艺参数准确可靠，具有实用价值。
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