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摘要 [目的]建立续骨酒的定量定性检测方法，为续骨酒质量控制提供理论依据。[方法]采用薄层色谱法（TLC）对续骨酒中的栀子、地黄定性鉴别；采用高效液相色谱法（HPLC）测定栀子苷的含量。[结果]TLC鉴别分离度好、专属性强；含量测定中栀子苷在0.151 1～2.518 0 mg范围内呈良好线性关系，线性回归方程为Y=925 558X- 11 386，r=0.999 9（n=7），平均回收率为99.4%，RSD%为1.4。[结论]该试验所建立的方法简便、准确、专属性强、精密度高、重复性好，可作为续骨酒的质量控制方法。
关键词：续骨酒；质量标准；地黄；栀子苷
中图分类号：S567 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）08-047-03
续骨酒是广州市正骨医院的一个常用制剂。续骨酒主要由闹羊花、续断、栀子、姜黄、生地黄、独活等中药组成，具有活血化瘀、消肿止痛、驱风祛湿、舒筋通络的功效，对各种骨折肿痛、跌打损伤、风湿骨痛有确切的疗效。续骨酒是一安全、有效、使用方便的外用喷雾剂，很受患者欢迎，却至今缺乏一个全面、完善的质量标准。现行的续骨酒内控质量标准中只有2010年版中国药典中有关喷雾剂通则项下的检查，包括外观、总固体、乙醇量、装量、微生物限度等项目，这些检查项既不能保证制剂的质量，亦保障不了临床用药的有效性和安全性，因此很有必要对续骨酒中的药材和有效成分进行鉴别，并测定其有效成分的含量，以提高续骨酒的质量和临床用药的有效性。笔者采用薄层色谱法对栀子、地黄进行定性鉴别，用高效液相色谱法对续骨酒中栀子苷进行了含量测定，为续骨酒质量标准的制定提供一定的科学依据，也为续骨酒后期在临床上的发展应用奠定基础。
1 材料和方法
1.1 仪器 岛津高效液相色谱仪（LC-10ATvp泵、SPD-10Avp紫外检测器、CTO-10ASvp柱温箱、CBM-20A控制器、SIL-20A自动进样器，LC solution化学工作站）；KQ-300型超声波清洗器（功率300 W，频率40 kHz，东莞市科桥超声波设备有限公司）；AUW220D型万分之一分析天平（日本SHIMADZU公司）；Goodlook-1000型薄层色谱成像系统（上海科哲生化科技有限公司）；薄层层析硅胶G板（德国MACHEREY-NAGEL公司，批号006153）。
1.2 试药 栀子对照药材（批号120986-201309，中国药品生物制品检定所），地黄对照药材（批号121180-201005，中国药品生物制品检定所），栀子苷对照品（批号110749-201316，中国药品生物制品检定所）；续骨酒（广州市正骨医院，批号20140101、20140201、20140301、20140401、20140501）和续骨酒栀子阴性溶液（广州市正骨医院）；甲醇为色谱纯，其余为分析纯。
1.3 方法
1.3.1 栀子的TLC鉴别 。取本品20 ml，蒸干，加乙醇2 ml使溶解，作为供试品溶液；取缺栀子的阴性对照样品20 ml，同法制成缺栀子阴性对照溶液；再取栀子对照药材1 g，加50%甲醇10 ml，超声40 min，滤过，取续滤液作为对照药材溶液；另取栀子苷对照品，加乙醇制成每1 ml含4 mg的溶液，作为对照品溶液。按照薄层色谱法[1]试验，吸取上述供试品溶液和阴性对照溶液各4 ml、对照药材溶液及对照品溶液各2 ml，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丙酮-氨水-甲醇-水（5∶5∶1∶0.5∶0.5）为展开剂[2]，展开，取出，晾干。喷以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加热至斑点清晰。在日光下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，应分别显相同颜色的斑点，阴性对照应无干扰。
1.3.2 地黄的TLC鉴别。取续骨酒原液作为供试品溶液。取地黄对照药材1 g，加80%甲醇50 ml，超声30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水5 ml使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取4次，每次10 ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇2 ml使溶解，作为对照药材溶液。按照薄层色谱法试验[1]，吸取供试品溶液和对照药材溶液各5 ml，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水-甲醇（6∶3∶3∶2）为展开剂[3]，展开，取出，晾干。喷以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加热至斑点清晰。在日光下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，应分别显相同颜色的斑点，应阴性对照无干扰。
1.3.3 栀子苷的含量测定。
1.3.3.1 色谱条件与系统适用性试验。色谱柱为迪马ODS色谱柱（250×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇-水（20∶80），流速1.0 ml/min；柱温30 ℃；检测波长237 nm。理论塔板数按栀子苷峰计算应不低于3 000。
1.3.3.2 供试品溶液的制备。精密吸取续骨酒10 ml，置于25 ml容量瓶，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45 mm孔径微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。
1.3.3.3 对照品溶液的制备。取栀子苷对照品适量，精密称定，置于50 ml容量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成含251.8 mg/ml的对照品溶液；精密吸取上述对照品溶液5 ml，置于20 ml容量瓶，加入甲醇至刻度，摇匀，制得含62.94 mg/ml的栀子苷对照品溶液。
1.3.3.4 阴性对照溶液的制备。按缺栀子的阴性对照样品，按“1.3.3.2”项下方法制备，即得缺栀子阴性对照溶液。
1.3.3.5 测定方法。分别精密吸取供试品溶液及对照品溶液各10 μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得。
1.3.3.6 标准曲线的制备及线性考察。精密吸取栀子苷对照品溶液（251.8 mg/ml）各0.6、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 ml，分别注入高效液相色谱仪，按“1.3.3.1”色谱条件进行测定并绘制标准曲线。 1.3.3.7 稳定性试验。将按“1.3.3.2”项制备的供试品溶液（批号20140101）于0、2、4、8、12、24 h分别进样10 μl，按“1.3.3.1”色谱条件测定。
1.3.3.8 精密度试验。精密取栀子苷对照品溶液10 μl，采用高效液相色谱法，连续测定6次。
1.3.3.9 重复性试验。取供试品溶液（批号20140101）按“1.3.3.5”项下方法，连续测定6次。
1.3.3.10 加样回收试验。在已知含量的续骨酒加入一定量的栀子苷对照品溶液，按“1.3.3.5”项下方法测定，并计算回收率。
1.3.3.11 样品测定。精密称取续骨酒样品，按“1.3.3.2”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10 μl，采用高效液相色谱法测定。
2 结果与分析
2.1 栀子的TLC鉴别 从图1可以看出，供试品色谱中，在与栀子对照药材色谱和栀子苷对照品色谱相应的位置上，分别显相同颜色的斑点，缺栀子阴性对照品色谱相应的位置上没有干扰。
2.2 地黄的TLC鉴别 从图2可以看出，在与地黄对照药材色谱显相同颜色的斑点，缺地黄阴性对照品色谱相应的位置上没有干扰。
2.3 栀子苷的含量测定
2.3.1 色谱条件及系统适应性试验。在该色谱条件下检测，绘制供试品、栀子苷对照品和缺栀子阴性对照品色谱图（图3）。由图3可见，供试品和栀子苷对照品在相同的保留时间（32.5 min），缺栀子阴性对照品在相对应的保留时间没有影响。供试品所测定主峰附近无明显杂峰，经计算，样品主峰与其他组分峰的分离度>1.5。
2.3.2 标准曲线的制备及线性考察。通过“1.3.3.1”色谱条件测定栀子苷对照品，以栀子苷进样量（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得出线性回归方程为Y=925 558X- 11 386（r=0.999 9），结果表明，栀子苷在0.151 1～2.518 0 mg范围内呈良好的线性关系。
2.3.3 稳定性试验。按“1.3.3.7”项，分别于0、2、4、8、12、24 h测定续骨酒中的栀子苷。测得24 h内平均峰面积为662 523，RSD=2.1%（n=6），表明被测样品在24 h内稳定。
2.3.4 精密度试验。按“1.3.3.8”项，连续测定6次，测得平均峰面积为590 545，RSD=1.1%，表明在此试验条件下精密度良好。
2.3.5 重复性试验。按“1.3.3.9”项，连续测定6次。测得同一批号中，平均峰面积为660 066，栀子苷平均浓度为173.7 μg/ml，RSD=1.2%，结果显示重复性良好。
2.3.6 加样回收试验。由表1可见，该试验方法中栀子苷的平均回收率达99.4%，RSD为1.4%，表明该方法准确、可靠，可用于续骨酒中栀子苷的含量测定。
2.3.7 样品测定。由表2可知，3批续骨酒中栀子苷含量为155.1～176.6 μg/ml，平均含量为163.6 μg/ml，RSD为0.20%～0.49%。
3 小结与讨论
（1）栀子的薄层色谱鉴别中，按药典方法的展开系统分离效果较差，经查阅文献，改用乙酸乙酯-丙酮-氨水-甲醇-水（5∶5∶1∶0.5∶0.5）为展开剂，结果显示斑点清晰、分离度好，可作为续骨酒的定性鉴别指标。
（2）地黄的薄层色谱鉴别中，按药典方法的展开系统分离效果较差，斑点模糊，经查阅文献，改用正丁醇-冰醋酸-水-甲醇（6∶3∶3∶2）为展开剂，结果显示斑点清晰、分离度好，可作为续骨酒的定性鉴别指标。
（3）该研究采用HPLC法测定了续骨酒中栀子苷的含量，样品分离度高，测定方法重复性良好、回收率高、专属性强，可作为该制剂质量控制的含量测定指标。
（4）该研究测得续骨酒中栀子苷的平均含量为163.6 μg/ml，考虑到药材来源、制剂生产等因素，暂规定本品每毫升中含栀子以栀子苷（C17H24O10）计，不得少于90 μg/ml。
参考文献
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：中国医药科技出版社， 2010：231， 附录34-35.
[2] 方道硕， 钟亚玲， 宋英. 清热泻火胶囊的质量标准[J]. 中国药师， 2008， 11（4）： 406- 408.
[3] 冯文涛， 谢颖， 张榕. 凉血颗粒所用药材的薄层鉴别[J]. 华西药学杂志， 2008， 23（4）： 502.
关键词：续骨酒；质量标准；地黄；栀子苷
中图分类号：S567 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）08-047-03
续骨酒是广州市正骨医院的一个常用制剂。续骨酒主要由闹羊花、续断、栀子、姜黄、生地黄、独活等中药组成，具有活血化瘀、消肿止痛、驱风祛湿、舒筋通络的功效，对各种骨折肿痛、跌打损伤、风湿骨痛有确切的疗效。续骨酒是一安全、有效、使用方便的外用喷雾剂，很受患者欢迎，却至今缺乏一个全面、完善的质量标准。现行的续骨酒内控质量标准中只有2010年版中国药典中有关喷雾剂通则项下的检查，包括外观、总固体、乙醇量、装量、微生物限度等项目，这些检查项既不能保证制剂的质量，亦保障不了临床用药的有效性和安全性，因此很有必要对续骨酒中的药材和有效成分进行鉴别，并测定其有效成分的含量，以提高续骨酒的质量和临床用药的有效性。笔者采用薄层色谱法对栀子、地黄进行定性鉴别，用高效液相色谱法对续骨酒中栀子苷进行了含量测定，为续骨酒质量标准的制定提供一定的科学依据，也为续骨酒后期在临床上的发展应用奠定基础。
1 材料和方法
1.1 仪器 岛津高效液相色谱仪（LC-10ATvp泵、SPD-10Avp紫外检测器、CTO-10ASvp柱温箱、CBM-20A控制器、SIL-20A自动进样器，LC solution化学工作站）；KQ-300型超声波清洗器（功率300 W，频率40 kHz，东莞市科桥超声波设备有限公司）；AUW220D型万分之一分析天平（日本SHIMADZU公司）；Goodlook-1000型薄层色谱成像系统（上海科哲生化科技有限公司）；薄层层析硅胶G板（德国MACHEREY-NAGEL公司，批号006153）。
1.2 试药 栀子对照药材（批号120986-201309，中国药品生物制品检定所），地黄对照药材（批号121180-201005，中国药品生物制品检定所），栀子苷对照品（批号110749-201316，中国药品生物制品检定所）；续骨酒（广州市正骨医院，批号20140101、20140201、20140301、20140401、20140501）和续骨酒栀子阴性溶液（广州市正骨医院）；甲醇为色谱纯，其余为分析纯。
1.3 方法
1.3.1 栀子的TLC鉴别 。取本品20 ml，蒸干，加乙醇2 ml使溶解，作为供试品溶液；取缺栀子的阴性对照样品20 ml，同法制成缺栀子阴性对照溶液；再取栀子对照药材1 g，加50%甲醇10 ml，超声40 min，滤过，取续滤液作为对照药材溶液；另取栀子苷对照品，加乙醇制成每1 ml含4 mg的溶液，作为对照品溶液。按照薄层色谱法[1]试验，吸取上述供试品溶液和阴性对照溶液各4 ml、对照药材溶液及对照品溶液各2 ml，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丙酮-氨水-甲醇-水（5∶5∶1∶0.5∶0.5）为展开剂[2]，展开，取出，晾干。喷以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加热至斑点清晰。在日光下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，应分别显相同颜色的斑点，阴性对照应无干扰。
1.3.2 地黄的TLC鉴别。取续骨酒原液作为供试品溶液。取地黄对照药材1 g，加80%甲醇50 ml，超声30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水5 ml使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取4次，每次10 ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇2 ml使溶解，作为对照药材溶液。按照薄层色谱法试验[1]，吸取供试品溶液和对照药材溶液各5 ml，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水-甲醇（6∶3∶3∶2）为展开剂[3]，展开，取出，晾干。喷以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加热至斑点清晰。在日光下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，应分别显相同颜色的斑点，应阴性对照无干扰。
1.3.3 栀子苷的含量测定。
1.3.3.1 色谱条件与系统适用性试验。色谱柱为迪马ODS色谱柱（250×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇-水（20∶80），流速1.0 ml/min；柱温30 ℃；检测波长237 nm。理论塔板数按栀子苷峰计算应不低于3 000。
1.3.3.2 供试品溶液的制备。精密吸取续骨酒10 ml，置于25 ml容量瓶，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45 mm孔径微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。
1.3.3.3 对照品溶液的制备。取栀子苷对照品适量，精密称定，置于50 ml容量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成含251.8 mg/ml的对照品溶液；精密吸取上述对照品溶液5 ml，置于20 ml容量瓶，加入甲醇至刻度，摇匀，制得含62.94 mg/ml的栀子苷对照品溶液。
1.3.3.4 阴性对照溶液的制备。按缺栀子的阴性对照样品，按“1.3.3.2”项下方法制备，即得缺栀子阴性对照溶液。
1.3.3.5 测定方法。分别精密吸取供试品溶液及对照品溶液各10 μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得。
1.3.3.6 标准曲线的制备及线性考察。精密吸取栀子苷对照品溶液（251.8 mg/ml）各0.6、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 ml，分别注入高效液相色谱仪，按“1.3.3.1”色谱条件进行测定并绘制标准曲线。 1.3.3.7 稳定性试验。将按“1.3.3.2”项制备的供试品溶液（批号20140101）于0、2、4、8、12、24 h分别进样10 μl，按“1.3.3.1”色谱条件测定。
1.3.3.8 精密度试验。精密取栀子苷对照品溶液10 μl，采用高效液相色谱法，连续测定6次。
1.3.3.9 重复性试验。取供试品溶液（批号20140101）按“1.3.3.5”项下方法，连续测定6次。
1.3.3.10 加样回收试验。在已知含量的续骨酒加入一定量的栀子苷对照品溶液，按“1.3.3.5”项下方法测定，并计算回收率。
1.3.3.11 样品测定。精密称取续骨酒样品，按“1.3.3.2”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10 μl，采用高效液相色谱法测定。
2 结果与分析
2.1 栀子的TLC鉴别 从图1可以看出，供试品色谱中，在与栀子对照药材色谱和栀子苷对照品色谱相应的位置上，分别显相同颜色的斑点，缺栀子阴性对照品色谱相应的位置上没有干扰。
2.2 地黄的TLC鉴别 从图2可以看出，在与地黄对照药材色谱显相同颜色的斑点，缺地黄阴性对照品色谱相应的位置上没有干扰。
2.3 栀子苷的含量测定
2.3.1 色谱条件及系统适应性试验。在该色谱条件下检测，绘制供试品、栀子苷对照品和缺栀子阴性对照品色谱图（图3）。由图3可见，供试品和栀子苷对照品在相同的保留时间（32.5 min），缺栀子阴性对照品在相对应的保留时间没有影响。供试品所测定主峰附近无明显杂峰，经计算，样品主峰与其他组分峰的分离度>1.5。
2.3.2 标准曲线的制备及线性考察。通过“1.3.3.1”色谱条件测定栀子苷对照品，以栀子苷进样量（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得出线性回归方程为Y=925 558X- 11 386（r=0.999 9），结果表明，栀子苷在0.151 1～2.518 0 mg范围内呈良好的线性关系。
2.3.3 稳定性试验。按“1.3.3.7”项，分别于0、2、4、8、12、24 h测定续骨酒中的栀子苷。测得24 h内平均峰面积为662 523，RSD=2.1%（n=6），表明被测样品在24 h内稳定。
2.3.4 精密度试验。按“1.3.3.8”项，连续测定6次，测得平均峰面积为590 545，RSD=1.1%，表明在此试验条件下精密度良好。
2.3.5 重复性试验。按“1.3.3.9”项，连续测定6次。测得同一批号中，平均峰面积为660 066，栀子苷平均浓度为173.7 μg/ml，RSD=1.2%，结果显示重复性良好。
2.3.6 加样回收试验。由表1可见，该试验方法中栀子苷的平均回收率达99.4%，RSD为1.4%，表明该方法准确、可靠，可用于续骨酒中栀子苷的含量测定。
2.3.7 样品测定。由表2可知，3批续骨酒中栀子苷含量为155.1～176.6 μg/ml，平均含量为163.6 μg/ml，RSD为0.20%～0.49%。
3 小结与讨论
（1）栀子的薄层色谱鉴别中，按药典方法的展开系统分离效果较差，经查阅文献，改用乙酸乙酯-丙酮-氨水-甲醇-水（5∶5∶1∶0.5∶0.5）为展开剂，结果显示斑点清晰、分离度好，可作为续骨酒的定性鉴别指标。
（2）地黄的薄层色谱鉴别中，按药典方法的展开系统分离效果较差，斑点模糊，经查阅文献，改用正丁醇-冰醋酸-水-甲醇（6∶3∶3∶2）为展开剂，结果显示斑点清晰、分离度好，可作为续骨酒的定性鉴别指标。
（3）该研究采用HPLC法测定了续骨酒中栀子苷的含量，样品分离度高，测定方法重复性良好、回收率高、专属性强，可作为该制剂质量控制的含量测定指标。
（4）该研究测得续骨酒中栀子苷的平均含量为163.6 μg/ml，考虑到药材来源、制剂生产等因素，暂规定本品每毫升中含栀子以栀子苷（C17H24O10）计，不得少于90 μg/ml。
参考文献
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：中国医药科技出版社， 2010：231， 附录34-35.
[2] 方道硕， 钟亚玲， 宋英. 清热泻火胶囊的质量标准[J]. 中国药师， 2008， 11（4）： 406- 408.
[3] 冯文涛， 谢颖， 张榕. 凉血颗粒所用药材的薄层鉴别[J]. 华西药学杂志， 2008， 23（4）： 502.