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摘要 [目的] 探索出一套较好的大麦总RNA提取方法。[方法]以大麦的叶片、茎秆和子粒为试验材料，探索各器官总RNA提取方法。[结果]所得产物的检验结果表明，总RNA具有整齐且清晰的28S rRNA、18S rRNA条带，A260/A280均介于1.8～2.0。将提取的叶片总RNA反转录成cDNA，RT.PCR检测PCR产物在1 500 bp处。[结论]用此方法提取的大麦各器官总RNA质量较好，纯度较高，完整性较好，可用于进一步的分子生物学研究。
关键词 大麦；总RNA；提取
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）17-033-02
Abstract [Objective] The aim was to explore total RNA extraction methods for different organs of barley. [Method] Using barley leaves， stems and grains as the experimental materials ， the total RNA extraction method of these organs were explored. [Result]The detected results of these products showed that the total RNA had clear and neat stripes of 28S rRNA and 18S rRNA in the RNA electrophoresis. The ratios of A260/A280 were between 1.8 to 2.0. Leaves total RNA isolated by these methods were reverse transcribed and high quality cDNA were obtained. RT.PCR detected the product of PCR was in the 1 500 bp.[Conclusion]These results showed that the quality of the extracted barley total RNA were good， high purity， good integrity， and were suitable for further research in molecular biology.
Key words Barley； Total RNA； Extraction
大麦（Hordeum vulgare L.）属于禾本科小麦族大麦属普通大麦种，因营养价值高，兼有食用、饲用和酿造用等多种用途，在农业生产和国民经济发展中具有重要意义[1] 。
从植物组织中提取纯度高和完整性好的RNA是进行Northern 杂交分析、建立cDNA 文库、RT.PCR、基因体外翻译、DDRT.PCR、cDNA 末端快速扩增及差异显示分析等分子生物学研究的重要前提。目前，提取植物RNA的方法有很多种，如Trizol 试剂快速提取法、CTAB法、热硼酸法及改良的热硼酸法、苯酚法、LiCl.尿素法及总RNA提取试剂盒等。但由于不同植物或同种植物不同组织所含成分不同，需要选择不同的方法，或者对一些方法进行调整和改进。运用上述方法，许多学者提取了水稻、小麦、玉米、大豆、高粱等植物的总RNA，为这些植物后续的分子生物学研究奠定基础。迄今为止，关于大麦各器官总RNA提取方法的研究较少。笔者以大麦的叶片、茎秆和子粒为试验材料，参照小麦多种总RNA的提取方法，探索出一套较好的大麦总RNA提取方法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试材料。
蒙啤麦1号，由内蒙古农牧业科学研究院提供，在大麦灌浆中后期分别取叶片、茎秆和子粒，保存于-80 ℃的冰箱中待用。
1.1.2 主要试剂。
RNAiso Plus、反转录试剂盒购自宝生物工程有限公司，DEPC处理水、水饱和酚、Agarose购自北京索莱宝科技有限公司，三氯甲烷（氯仿）、异丙醇、异戊醇、无水乙醇购自天津市东丽区天大化学试剂厂。
1.1.3 主要仪器。
超低温冰箱、高压灭菌锅、烘箱、电子天平、超净工作台、快速混匀器、高速冷冻离心机、电泳仪、紫外凝胶成像、紫外可见分光光度计、PCR仪。
1.1.4 试验用品的处理。
将用于提取RNA的离心管、枪头等浸泡于0.1%DEPC溶液中12 h，121 ℃高压灭菌30 min，70～80 ℃烘干，备用。研钵用报纸包装，121 ℃高压灭菌30 min，160 ℃烘干，备用。用75%的乙醇擦拭超净工作台、离心机、离心管架、移液枪、试剂瓶等。
1.2 试验方法
1.2.1 叶片的提取方法。
①取0.2 g叶片加入液氮研磨至粉末状移入1.5 ml离心管；②立即加入1 ml RNAiso plus试剂，使用快速混匀器剧烈振荡15 s，混匀样品；③将其水平静置5 min；④ 4 ℃，12 000 r/min，离心5 min；⑤移澄清上清液入一新的1.5 ml离心管中加入0.2 ml氯仿，盖紧管盖，剧烈振荡15 s，室温静置5 min；⑥4 ℃，12 000 r/min，离心15 min；⑦移最上层水相到新的1.5 ml离心管中，加入0.25 ml NaAc和使其终浓度为10%的无水乙醇，盖紧管盖，轻轻混匀，室温静置10 min；⑧4 ℃，12 000 r/min，离心5 min；⑨移澄清上清液入一新的1.5 ml离心管中加入1/5 体积的氯仿，剧烈振荡15 s，室温静置5 min；⑩4 ℃，12 000 r/min，离心10 min；B11取上清水相，加等体积的异丙醇，轻轻混匀，静置10 min；B12 4 ℃，12 000 r/min，离心10 min；B13弃上清，留沉淀，加入1 ml预冷的75%乙醇（用DEPC水配制）洗沉淀，轻轻混匀，4 ℃，12 000 r/min离心5 min；B14弃上清，待其干燥（5～10 min），用适量DEPC水溶解沉淀，保存于-80 ℃的冰箱。 1.2.2 茎秆的提取方法。
①取0.2 g茎加入液氮研磨至粉末状移入1.5 ml离心管；②立即加入1 ml RNAiso plus试剂，使用快速混匀器剧烈振荡15 s，混匀样品；③将其水平静置5 min；④4 ℃，12 000 r/min，离心5 min；⑤移澄清上清液入一新的1.5 ml离心管中加入0.2 ml配好的水饱和酚∶氯仿∶异戊醇中（V/V/V=25∶24∶1），盖紧管盖，剧烈振荡15 s，室温静置5 min；⑥4 ℃，12 000 r/min，离心15 min；⑦移最上层水相到新的1.5 ml离心管中，移澄清上清液入一新的1.5 ml离心管中加入1/5 上清液体积的氯仿，盖紧管盖，剧烈振荡15 s，室温静置5 min；⑧4 ℃，12 000 r/min，离心10 min；⑨移最上层水相到新的1.5 ml离心管中，加入使其终浓度为10%的无水乙醇，盖紧管盖，轻轻混匀，室温静置10 min；⑩4 ℃，12 000 r/min，离心5 min；B11取上清水相，加等体积的异丙醇，轻轻混匀，静置10 min；B124 ℃，12 000 r/min，离心10 min；B13弃上清，留沉淀，加入1 ml预冷的75%乙醇（用DEPC水配制）洗沉淀，轻轻混匀，4 ℃，12 000 r/min，离心5 min；B14弃上清，待其干燥（5～10 min），用适量DEPC水溶解沉淀，保存于-80 ℃的冰箱。
1.2.3 子粒的提取方法。
①取0.2 g子粒加入液氮研磨至粉末状移入1.5 ml离心管；②立即加入1 ml RNAiso plus试剂，0.1 ml巯基乙醇，使用快速混匀器剧烈振荡15 s，混匀样品；③将其水平静置10 min；④4 ℃，12 000 r/min，离心15 min；⑤移澄清上清液入一新的1.5 ml离心管中加入等体积配好的水饱和酚∶氯仿∶异戊醇（V∶V∶V=25∶24∶1），盖紧管盖，剧烈振荡15 s，室温静置10 min；⑥4 ℃，12 000 r/min，离心15 min；⑦移澄清上清液入一新的1.5 ml离心管中加入1/20体积上清液的4 mol/L KAc（pH 5.5），加入1/10体积上清液的预冷无水乙醇，混匀，再加入等体积配好的氯仿∶异戊醇（V∶V=24∶1），剧烈振荡15 s，室温静置10 min；⑧4 ℃，12 000 r/min，离心15 min；⑨取上清加2倍体积预冷无水乙醇，轻轻混匀；⑩-20 ℃放置1 h；B114 ℃，12 000 r/min，离心15 min；B12弃上清，留沉淀，加入1 ml预冷的75%乙醇（用DEPC水配制）洗沉淀，轻轻混匀，4 ℃，12 000 r/min，离心5 min；B13重复B12的操作；B14弃上清，待其干燥（5～10 min），用适量DEPC水溶解沉淀，保存于-80 ℃的冰箱。
1.3 RNA检测
1.3.1 质量检测。
用紫外分光光度计检测纯度，用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。
1.3.2 完整性检测。
用TaKaRa公司的RR047A反转录试剂盒，取2 μl叶片总RNA为模板，反转录体系参照说明书进行。利用DMGP引物进行PCR扩增试验，第一次PCR反应体系（25 μl）中包括 2.5 μl cDNA，2.5 μl 1×ExTaq buffer，2 μl dNTP，0.5 μl GSR，0.5 μl GSF，0.25 μl ExTaq，16.75 μl ddH2O。第二次PCR反应体系是取2.5 μl第一次反应产物，加入试剂同第一次反应体系。2次反应程序相同：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，55 ℃延伸40 s，72 ℃退火90 s ，25个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃下保存，如需长期保存，应于-20 ℃或更低温度保存。用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
2 结果与分析
2.1 质量检测
经紫外可见分光光度检测，所提叶片、茎秆、子粒RNA的A260/A280 分别为1.98、1.95、1.88，在1.8～2.0，表明RNA的纯度较高，能够达到分子生物学试验的要求。
琼脂糖凝胶电泳结果见图1～3。利用此方法提取的总RNA 可见清晰3条带，从上至下分别是28S、18S 及5S。
但所提总RNA有轻微拖尾、弥散和降解现象，可能原因有：①来自未处理干净的超净工作台、研钵、试剂瓶、离心管和电泳槽的RNase污染；②在接触没有经过处理的物品后，手套可能会沾染上RNase，若未经常换新手套，RNase很容易进入离心管，使RNA降解；③提取步骤多且时间过长，会影响提取RNA的回收率和质量。此外，子粒总RNA用DEPC水溶解时有不溶性的胶状物存在，可能是因为大麦子粒含有的酚类化合物被氧化后与RNA不可逆地结合，形成
不溶性复合物[2]，也可能是未除尽的多糖形成难溶的胶状物，与不溶性复合物[2]，也可能是未除尽的多糖形成难溶的胶状物，与RNA共同沉淀下来[3]。因此，提取子粒的方法仍有待于进一步优化。
2.2 完整性检测
图4表明能成功地扩增出目的片段，说明提取的RNA样品质量好，可以进一步用于后续试验。
3 讨论
研究表明，来源于不同基因型植株同一种植物的同一种
组织材料，其RNA提取方法也可能不同[4] 。该试验结果说
明提取大麦叶片、茎秆、子粒总RNA的3种方法较好，适用于蒙啤麦1号的RNA提取，为提取其他品种大麦的RNA奠定良好的基础。影响总RNA提取质量的因素是多方面的，如组织的破碎程度，RNase的活性，多糖和蛋白质等大分子物质的存在[5]，操作中避免上述因素较难做到，因此提取较高质量总RNA一直是分子生物学研究的基础与重点。该试验提取的RNA质量有待于提高，试验方法仍有不足，需要进一步优化。由于该试验所用大麦材料均为保存在-80 ℃且是灌浆中后期的材料，若是幼嫩或新鲜材料提取效果会更好。
参考文献
[1] 卢良恕.中国大麦学[M].北京：中国农业出版社，1995：339-361.
[2] GRAHAM G C.A method for extraction of total RNA from Pinus radiata and other conifers[J].Plant Mol Biol Reptr，1993，11：32-37.
[3] LEWINSOHN E，STEELE C L，CROTEAU R.Simple isolation of functional RNA from woody stems of gymnosperms[J].Plant Mol Biol Reptr，1994，12：20-25.
[4] SU X，GIBOR A.A method for RNA isolation from marine macroalgae[J]. Anal Biochem，1988，174：650-657.
[5] 李宏，王新力.植物组织RNA提取的难点及对策[J].生物技术通报，1999，15（1）：36-39.
关键词 大麦；总RNA；提取
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）17-033-02
Abstract [Objective] The aim was to explore total RNA extraction methods for different organs of barley. [Method] Using barley leaves， stems and grains as the experimental materials ， the total RNA extraction method of these organs were explored. [Result]The detected results of these products showed that the total RNA had clear and neat stripes of 28S rRNA and 18S rRNA in the RNA electrophoresis. The ratios of A260/A280 were between 1.8 to 2.0. Leaves total RNA isolated by these methods were reverse transcribed and high quality cDNA were obtained. RT.PCR detected the product of PCR was in the 1 500 bp.[Conclusion]These results showed that the quality of the extracted barley total RNA were good， high purity， good integrity， and were suitable for further research in molecular biology.
Key words Barley； Total RNA； Extraction
大麦（Hordeum vulgare L.）属于禾本科小麦族大麦属普通大麦种，因营养价值高，兼有食用、饲用和酿造用等多种用途，在农业生产和国民经济发展中具有重要意义[1] 。
从植物组织中提取纯度高和完整性好的RNA是进行Northern 杂交分析、建立cDNA 文库、RT.PCR、基因体外翻译、DDRT.PCR、cDNA 末端快速扩增及差异显示分析等分子生物学研究的重要前提。目前，提取植物RNA的方法有很多种，如Trizol 试剂快速提取法、CTAB法、热硼酸法及改良的热硼酸法、苯酚法、LiCl.尿素法及总RNA提取试剂盒等。但由于不同植物或同种植物不同组织所含成分不同，需要选择不同的方法，或者对一些方法进行调整和改进。运用上述方法，许多学者提取了水稻、小麦、玉米、大豆、高粱等植物的总RNA，为这些植物后续的分子生物学研究奠定基础。迄今为止，关于大麦各器官总RNA提取方法的研究较少。笔者以大麦的叶片、茎秆和子粒为试验材料，参照小麦多种总RNA的提取方法，探索出一套较好的大麦总RNA提取方法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试材料。
蒙啤麦1号，由内蒙古农牧业科学研究院提供，在大麦灌浆中后期分别取叶片、茎秆和子粒，保存于-80 ℃的冰箱中待用。
1.1.2 主要试剂。
RNAiso Plus、反转录试剂盒购自宝生物工程有限公司，DEPC处理水、水饱和酚、Agarose购自北京索莱宝科技有限公司，三氯甲烷（氯仿）、异丙醇、异戊醇、无水乙醇购自天津市东丽区天大化学试剂厂。
1.1.3 主要仪器。
超低温冰箱、高压灭菌锅、烘箱、电子天平、超净工作台、快速混匀器、高速冷冻离心机、电泳仪、紫外凝胶成像、紫外可见分光光度计、PCR仪。
1.1.4 试验用品的处理。
将用于提取RNA的离心管、枪头等浸泡于0.1%DEPC溶液中12 h，121 ℃高压灭菌30 min，70～80 ℃烘干，备用。研钵用报纸包装，121 ℃高压灭菌30 min，160 ℃烘干，备用。用75%的乙醇擦拭超净工作台、离心机、离心管架、移液枪、试剂瓶等。
1.2 试验方法
1.2.1 叶片的提取方法。
①取0.2 g叶片加入液氮研磨至粉末状移入1.5 ml离心管；②立即加入1 ml RNAiso plus试剂，使用快速混匀器剧烈振荡15 s，混匀样品；③将其水平静置5 min；④ 4 ℃，12 000 r/min，离心5 min；⑤移澄清上清液入一新的1.5 ml离心管中加入0.2 ml氯仿，盖紧管盖，剧烈振荡15 s，室温静置5 min；⑥4 ℃，12 000 r/min，离心15 min；⑦移最上层水相到新的1.5 ml离心管中，加入0.25 ml NaAc和使其终浓度为10%的无水乙醇，盖紧管盖，轻轻混匀，室温静置10 min；⑧4 ℃，12 000 r/min，离心5 min；⑨移澄清上清液入一新的1.5 ml离心管中加入1/5 体积的氯仿，剧烈振荡15 s，室温静置5 min；⑩4 ℃，12 000 r/min，离心10 min；B11取上清水相，加等体积的异丙醇，轻轻混匀，静置10 min；B12 4 ℃，12 000 r/min，离心10 min；B13弃上清，留沉淀，加入1 ml预冷的75%乙醇（用DEPC水配制）洗沉淀，轻轻混匀，4 ℃，12 000 r/min离心5 min；B14弃上清，待其干燥（5～10 min），用适量DEPC水溶解沉淀，保存于-80 ℃的冰箱。 1.2.2 茎秆的提取方法。
①取0.2 g茎加入液氮研磨至粉末状移入1.5 ml离心管；②立即加入1 ml RNAiso plus试剂，使用快速混匀器剧烈振荡15 s，混匀样品；③将其水平静置5 min；④4 ℃，12 000 r/min，离心5 min；⑤移澄清上清液入一新的1.5 ml离心管中加入0.2 ml配好的水饱和酚∶氯仿∶异戊醇中（V/V/V=25∶24∶1），盖紧管盖，剧烈振荡15 s，室温静置5 min；⑥4 ℃，12 000 r/min，离心15 min；⑦移最上层水相到新的1.5 ml离心管中，移澄清上清液入一新的1.5 ml离心管中加入1/5 上清液体积的氯仿，盖紧管盖，剧烈振荡15 s，室温静置5 min；⑧4 ℃，12 000 r/min，离心10 min；⑨移最上层水相到新的1.5 ml离心管中，加入使其终浓度为10%的无水乙醇，盖紧管盖，轻轻混匀，室温静置10 min；⑩4 ℃，12 000 r/min，离心5 min；B11取上清水相，加等体积的异丙醇，轻轻混匀，静置10 min；B124 ℃，12 000 r/min，离心10 min；B13弃上清，留沉淀，加入1 ml预冷的75%乙醇（用DEPC水配制）洗沉淀，轻轻混匀，4 ℃，12 000 r/min，离心5 min；B14弃上清，待其干燥（5～10 min），用适量DEPC水溶解沉淀，保存于-80 ℃的冰箱。
1.2.3 子粒的提取方法。
①取0.2 g子粒加入液氮研磨至粉末状移入1.5 ml离心管；②立即加入1 ml RNAiso plus试剂，0.1 ml巯基乙醇，使用快速混匀器剧烈振荡15 s，混匀样品；③将其水平静置10 min；④4 ℃，12 000 r/min，离心15 min；⑤移澄清上清液入一新的1.5 ml离心管中加入等体积配好的水饱和酚∶氯仿∶异戊醇（V∶V∶V=25∶24∶1），盖紧管盖，剧烈振荡15 s，室温静置10 min；⑥4 ℃，12 000 r/min，离心15 min；⑦移澄清上清液入一新的1.5 ml离心管中加入1/20体积上清液的4 mol/L KAc（pH 5.5），加入1/10体积上清液的预冷无水乙醇，混匀，再加入等体积配好的氯仿∶异戊醇（V∶V=24∶1），剧烈振荡15 s，室温静置10 min；⑧4 ℃，12 000 r/min，离心15 min；⑨取上清加2倍体积预冷无水乙醇，轻轻混匀；⑩-20 ℃放置1 h；B114 ℃，12 000 r/min，离心15 min；B12弃上清，留沉淀，加入1 ml预冷的75%乙醇（用DEPC水配制）洗沉淀，轻轻混匀，4 ℃，12 000 r/min，离心5 min；B13重复B12的操作；B14弃上清，待其干燥（5～10 min），用适量DEPC水溶解沉淀，保存于-80 ℃的冰箱。
1.3 RNA检测
1.3.1 质量检测。
用紫外分光光度计检测纯度，用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。
1.3.2 完整性检测。
用TaKaRa公司的RR047A反转录试剂盒，取2 μl叶片总RNA为模板，反转录体系参照说明书进行。利用DMGP引物进行PCR扩增试验，第一次PCR反应体系（25 μl）中包括 2.5 μl cDNA，2.5 μl 1×ExTaq buffer，2 μl dNTP，0.5 μl GSR，0.5 μl GSF，0.25 μl ExTaq，16.75 μl ddH2O。第二次PCR反应体系是取2.5 μl第一次反应产物，加入试剂同第一次反应体系。2次反应程序相同：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，55 ℃延伸40 s，72 ℃退火90 s ，25个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃下保存，如需长期保存，应于-20 ℃或更低温度保存。用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
2 结果与分析
2.1 质量检测
经紫外可见分光光度检测，所提叶片、茎秆、子粒RNA的A260/A280 分别为1.98、1.95、1.88，在1.8～2.0，表明RNA的纯度较高，能够达到分子生物学试验的要求。
琼脂糖凝胶电泳结果见图1～3。利用此方法提取的总RNA 可见清晰3条带，从上至下分别是28S、18S 及5S。
但所提总RNA有轻微拖尾、弥散和降解现象，可能原因有：①来自未处理干净的超净工作台、研钵、试剂瓶、离心管和电泳槽的RNase污染；②在接触没有经过处理的物品后，手套可能会沾染上RNase，若未经常换新手套，RNase很容易进入离心管，使RNA降解；③提取步骤多且时间过长，会影响提取RNA的回收率和质量。此外，子粒总RNA用DEPC水溶解时有不溶性的胶状物存在，可能是因为大麦子粒含有的酚类化合物被氧化后与RNA不可逆地结合，形成
不溶性复合物[2]，也可能是未除尽的多糖形成难溶的胶状物，与不溶性复合物[2]，也可能是未除尽的多糖形成难溶的胶状物，与RNA共同沉淀下来[3]。因此，提取子粒的方法仍有待于进一步优化。
2.2 完整性检测
图4表明能成功地扩增出目的片段，说明提取的RNA样品质量好，可以进一步用于后续试验。
3 讨论
研究表明，来源于不同基因型植株同一种植物的同一种
组织材料，其RNA提取方法也可能不同[4] 。该试验结果说
明提取大麦叶片、茎秆、子粒总RNA的3种方法较好，适用于蒙啤麦1号的RNA提取，为提取其他品种大麦的RNA奠定良好的基础。影响总RNA提取质量的因素是多方面的，如组织的破碎程度，RNase的活性，多糖和蛋白质等大分子物质的存在[5]，操作中避免上述因素较难做到，因此提取较高质量总RNA一直是分子生物学研究的基础与重点。该试验提取的RNA质量有待于提高，试验方法仍有不足，需要进一步优化。由于该试验所用大麦材料均为保存在-80 ℃且是灌浆中后期的材料，若是幼嫩或新鲜材料提取效果会更好。
参考文献
[1] 卢良恕.中国大麦学[M].北京：中国农业出版社，1995：339-361.
[2] GRAHAM G C.A method for extraction of total RNA from Pinus radiata and other conifers[J].Plant Mol Biol Reptr，1993，11：32-37.
[3] LEWINSOHN E，STEELE C L，CROTEAU R.Simple isolation of functional RNA from woody stems of gymnosperms[J].Plant Mol Biol Reptr，1994，12：20-25.
[4] SU X，GIBOR A.A method for RNA isolation from marine macroalgae[J]. Anal Biochem，1988，174：650-657.
[5] 李宏，王新力.植物组织RNA提取的难点及对策[J].生物技术通报，1999，15（1）：36-39.