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摘要：针对传统DNA测定方法中存在的严重问题，提出了新型测定DNA的技术-电化学DNA传感器测定法。本文就电化学DNA传感器的工作原理和实用效果等，进行了论述。
关键词：电化学DNA传感器；电化学换能器；电位吸附法；杂交信息；基因诊断；靶基因；寡核苷酸
对DNA的研究是生命科学领域中极为重要的内容，在人体组织、血液、微生物、病毒等样本中特定DNA序列的定量检测有着十分重要的意义，尤其对疾病的早期准确诊断及治疗举足轻重。DNA分子是多聚脱氧核苷酸，由碱基、脱氧核糖和磷酸三部分组成。特定DNA的碱基序列与其互补链的杂交，是各种测定DNA技术的基础。
在研究者们的努力下，各种新的DNA检测技术不断出现。聚合酶链反应（PCR）是目前应用最为广泛的电化学测定DNA技术，它有很高的灵敏度，已被广泛地用于基因缺失和点突变的检测。大多数专家认为：实现快速、简便、准确、价廉的DNA测定，最有希望的是利用电化学传感器。
一、 电化学DNA生物传感器的工作原理
DNA传感器设计的依据是核酸杂交动力学,它的基本组成包括一个DNA探针和一个换能器，每一种属生物体内都含有其独特的核酸序列，因此设计检测核酸的生物传感器的关键是设计一段寡核苷酸序列探针。探针一般由若干个碱基的核苷酸组成,是一段单链核酸分子，其碱基序列与被测DNA片段的碱基序列互补,能够专一与特定的靶序列进行杂交，杂交过程具有很高的特异度和敏感度。换能器的功能是将DNA探针与被测定DNA片段的杂交信息转换为可测量信号,根据杂交前后测量信号的改变量,分析出被测DNA的量。
电化学DNA传感器，采用的是电化学换能器。电化学DNA传感器是根据固定在电极上的核苷酸与溶液中互补核酸杂交时，能引起电化学换能器的电压、电流或电导等电信号变化的原理设计的，通对电信号变化的检测可对样本中DNA的结构和含量等信息加以测定。电化学DNA传感器是目前研究者认为最有发展前景的一类DNA分析方法。
二、 DNA片段在固体电极上的固定化方法
电化学DNA传感器一般先用铂碳电极、石墨电极、碳糊电极、汞电极、金电极等固体电极作基础电极，DNA探针片段要有效地与之结合，不脱落且保持活性，其结合量应满足灵敏度的需要。所以探针的固定化是重要环节，决定着传感器的性能。
1. 吸附结合法。DNA片段很容易在电极表面发生吸附。热变性的单链核酸DNA(ssDNA)分子强烈地吸附于电极表面，质子化的DNA亦如此，而单链DNA分子发生电还原反应后的还原产物的吸附能力为最强。
2. 共价键结合法。该固定化方法首先要在电极表面修饰上一些活性官能团，如氨基，羧基等。这些活性官能团与ssDNA产生共价键，由此将DNA片段修饰在电极表面。Liu等采用共价键法在石墨电极上固定了DNA探针，先将石墨电极抛光，经过1:1HNO3、丙酮洗涤、再用蒸馏水在超声振荡下清洗后，将石墨电极置于K2Cr2O7与HNO3溶液中，在20mA电流下氧化10s，然后把电极放入氢化锂铝的乙醚溶液中1h，以使电极表面产生羟基。用乙醚冲洗电极后，将电极浸入3%的3-氨基丙基三氧基硅烷的甲苯溶液中24h,最后用甲苯冲洗电极。经以上步骤处理后，电极表面导入氨基。在修饰了氨基的电极表面上滴加50ul含有0.1mol/L DEC(乙基-3-二甲基丙基)碳二亚胺盐酸盐和0.1g /L ssDNA的0.1mol/L咪唑缓冲液(Ph 6.0)，在35℃下，恒温3h, ssDNA便修饰在电极表面上，清洗电极以除去未共价固定化的ssDNA后，用红外灯烘干，保存于TE缓冲液。
三、 杂交指示剂
DNA传感器对目标基因的选择性识别是靠核酸的杂交来完成的。为了检测所发生的杂交信息,必须采用一种电活性物质来指示,这种电活性物质被称为杂交指示剂。它能选择性地与dsDNA结合，且仍然能保持其电活性,在电极上发生氧化还原反应,产生可测量信号。就杂交指示剂的作用方式而言，可分为嵌入剂、电活性标记物等。
1. 嵌入式杂交指示剂。嵌入式杂交指示剂与DNA分子的作用，一是通过指示剂分子嵌入双链DNA双螺旋的碱基之间，二是通过指示剂分子与DNA骨架上的磷酸基之间的静电作用。比较有代表性的嵌入式杂交指示剂是蒽环抗生素类化合物，如道诺霉素、多柔比星、诺加霉素等。它们的共同结构特征是含有3个共平面的六元环所构成的四氢并四苯醌发色团。此外，也有染料、金属离子络合物等作为嵌入式杂交指示剂。
2. 电活性物质标记杂交指示剂。将电活性物质(如二茂铁、蒽醌、聚吡咯、聚噻吩等)标记在DNA探针上。当探针与靶基因发生杂交时，电流强度会发生改变。Bauerle等研究了碱基与聚噻吩的结合，首先观察单个碱基的作用，之后试验了15个碱基DNA与聚噻吩的作用情况，认为其作为杂交指示剂前景是乐观的。
四、 电化学DNA传感器在临床诊断中的应用
1. 细菌及病毒感染类疾病诊断。在传统方法中，细菌感染是通过体外血液培养来诊断的，这需要几日甚至几十日的时间，严重延误了疾病治疗，利用DNA传感器可快速检测细菌和病毒。
Wang等利用计时电位的测定方法，在碳糊电极上固定了两个长度分别为27和36碱基的DNA探针，此DNA探针与结核杆菌MTB的DR区DNA互补，可利用其杂交反应检测MTB含量，选择杂交指示剂CO(phen)。
2. 基因诊断。Wang等报道了艾滋病人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-I)相关的短DNA序列测定的传感器。它们将21个和24个碱基与HIV-IU5LTR序列互补的单链寡核苷酸部分修饰在碳糊电极(CPE)上,以杂交指示剂(Cophen)的计时溶出峰来检测杂交,靶基因片段检出限为4×10-9mol/L。Wang等又提出了以肽核酸(PNA)代替ssDNA作为探针修饰到电极表面，已证明PAN与互补和苷酸有很多杂交特性,在许多方面显示出优于ssDNA的性能,有望很好地用于基因诊断。
五、 展望
电化学DNA生物传感器作为一类新的传感器正在快速的发展，由于它在医学、临床诊断等领域中有着广泛的应用前景，倍受研究者的关注。但是，这种传感器尚存在易受干扰、重现性差等问题，仍限于实验室阶段。今后的研究目标主要是向使用化、小型化发展，并且在DNA固定化、信号转换等方面不断应用新技术，对传感器的性能进行改善和补充，使之更加适应实际应用的需要。
参考文献 ：
[1] Jacobs K， Wo1f S F， HainesL，et a1.Nucleic Acids Res，1987.
[2] Millan K M，Saraullo A，Mikkelsen S.Anal Chem，1994.
[3] 刘盛辉，孙长林，何品刚.方禹之.分析化学，1999.
[4] 庞代文，齐义鹏，王宗礼等.化学通报[J]，l994.
[5] 方禹之，刘盛辉，何品刚.高等学校化学学报，1996.
关键词：电化学DNA传感器；电化学换能器；电位吸附法；杂交信息；基因诊断；靶基因；寡核苷酸
对DNA的研究是生命科学领域中极为重要的内容，在人体组织、血液、微生物、病毒等样本中特定DNA序列的定量检测有着十分重要的意义，尤其对疾病的早期准确诊断及治疗举足轻重。DNA分子是多聚脱氧核苷酸，由碱基、脱氧核糖和磷酸三部分组成。特定DNA的碱基序列与其互补链的杂交，是各种测定DNA技术的基础。
在研究者们的努力下，各种新的DNA检测技术不断出现。聚合酶链反应（PCR）是目前应用最为广泛的电化学测定DNA技术，它有很高的灵敏度，已被广泛地用于基因缺失和点突变的检测。大多数专家认为：实现快速、简便、准确、价廉的DNA测定，最有希望的是利用电化学传感器。
一、 电化学DNA生物传感器的工作原理
DNA传感器设计的依据是核酸杂交动力学,它的基本组成包括一个DNA探针和一个换能器，每一种属生物体内都含有其独特的核酸序列，因此设计检测核酸的生物传感器的关键是设计一段寡核苷酸序列探针。探针一般由若干个碱基的核苷酸组成,是一段单链核酸分子，其碱基序列与被测DNA片段的碱基序列互补,能够专一与特定的靶序列进行杂交，杂交过程具有很高的特异度和敏感度。换能器的功能是将DNA探针与被测定DNA片段的杂交信息转换为可测量信号,根据杂交前后测量信号的改变量,分析出被测DNA的量。
电化学DNA传感器，采用的是电化学换能器。电化学DNA传感器是根据固定在电极上的核苷酸与溶液中互补核酸杂交时，能引起电化学换能器的电压、电流或电导等电信号变化的原理设计的，通对电信号变化的检测可对样本中DNA的结构和含量等信息加以测定。电化学DNA传感器是目前研究者认为最有发展前景的一类DNA分析方法。
二、 DNA片段在固体电极上的固定化方法
电化学DNA传感器一般先用铂碳电极、石墨电极、碳糊电极、汞电极、金电极等固体电极作基础电极，DNA探针片段要有效地与之结合，不脱落且保持活性，其结合量应满足灵敏度的需要。所以探针的固定化是重要环节，决定着传感器的性能。
1. 吸附结合法。DNA片段很容易在电极表面发生吸附。热变性的单链核酸DNA(ssDNA)分子强烈地吸附于电极表面，质子化的DNA亦如此，而单链DNA分子发生电还原反应后的还原产物的吸附能力为最强。
2. 共价键结合法。该固定化方法首先要在电极表面修饰上一些活性官能团，如氨基，羧基等。这些活性官能团与ssDNA产生共价键，由此将DNA片段修饰在电极表面。Liu等采用共价键法在石墨电极上固定了DNA探针，先将石墨电极抛光，经过1:1HNO3、丙酮洗涤、再用蒸馏水在超声振荡下清洗后，将石墨电极置于K2Cr2O7与HNO3溶液中，在20mA电流下氧化10s，然后把电极放入氢化锂铝的乙醚溶液中1h，以使电极表面产生羟基。用乙醚冲洗电极后，将电极浸入3%的3-氨基丙基三氧基硅烷的甲苯溶液中24h,最后用甲苯冲洗电极。经以上步骤处理后，电极表面导入氨基。在修饰了氨基的电极表面上滴加50ul含有0.1mol/L DEC(乙基-3-二甲基丙基)碳二亚胺盐酸盐和0.1g /L ssDNA的0.1mol/L咪唑缓冲液(Ph 6.0)，在35℃下，恒温3h, ssDNA便修饰在电极表面上，清洗电极以除去未共价固定化的ssDNA后，用红外灯烘干，保存于TE缓冲液。
三、 杂交指示剂
DNA传感器对目标基因的选择性识别是靠核酸的杂交来完成的。为了检测所发生的杂交信息,必须采用一种电活性物质来指示,这种电活性物质被称为杂交指示剂。它能选择性地与dsDNA结合，且仍然能保持其电活性,在电极上发生氧化还原反应,产生可测量信号。就杂交指示剂的作用方式而言，可分为嵌入剂、电活性标记物等。
1. 嵌入式杂交指示剂。嵌入式杂交指示剂与DNA分子的作用，一是通过指示剂分子嵌入双链DNA双螺旋的碱基之间，二是通过指示剂分子与DNA骨架上的磷酸基之间的静电作用。比较有代表性的嵌入式杂交指示剂是蒽环抗生素类化合物，如道诺霉素、多柔比星、诺加霉素等。它们的共同结构特征是含有3个共平面的六元环所构成的四氢并四苯醌发色团。此外，也有染料、金属离子络合物等作为嵌入式杂交指示剂。
2. 电活性物质标记杂交指示剂。将电活性物质(如二茂铁、蒽醌、聚吡咯、聚噻吩等)标记在DNA探针上。当探针与靶基因发生杂交时，电流强度会发生改变。Bauerle等研究了碱基与聚噻吩的结合，首先观察单个碱基的作用，之后试验了15个碱基DNA与聚噻吩的作用情况，认为其作为杂交指示剂前景是乐观的。
四、 电化学DNA传感器在临床诊断中的应用
1. 细菌及病毒感染类疾病诊断。在传统方法中，细菌感染是通过体外血液培养来诊断的，这需要几日甚至几十日的时间，严重延误了疾病治疗，利用DNA传感器可快速检测细菌和病毒。
Wang等利用计时电位的测定方法，在碳糊电极上固定了两个长度分别为27和36碱基的DNA探针，此DNA探针与结核杆菌MTB的DR区DNA互补，可利用其杂交反应检测MTB含量，选择杂交指示剂CO(phen)。
2. 基因诊断。Wang等报道了艾滋病人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-I)相关的短DNA序列测定的传感器。它们将21个和24个碱基与HIV-IU5LTR序列互补的单链寡核苷酸部分修饰在碳糊电极(CPE)上,以杂交指示剂(Cophen)的计时溶出峰来检测杂交,靶基因片段检出限为4×10-9mol/L。Wang等又提出了以肽核酸(PNA)代替ssDNA作为探针修饰到电极表面，已证明PAN与互补和苷酸有很多杂交特性,在许多方面显示出优于ssDNA的性能,有望很好地用于基因诊断。
五、 展望
电化学DNA生物传感器作为一类新的传感器正在快速的发展，由于它在医学、临床诊断等领域中有着广泛的应用前景，倍受研究者的关注。但是，这种传感器尚存在易受干扰、重现性差等问题，仍限于实验室阶段。今后的研究目标主要是向使用化、小型化发展，并且在DNA固定化、信号转换等方面不断应用新技术，对传感器的性能进行改善和补充，使之更加适应实际应用的需要。
参考文献 ：
[1] Jacobs K， Wo1f S F， HainesL，et a1.Nucleic Acids Res，1987.
[2] Millan K M，Saraullo A，Mikkelsen S.Anal Chem，1994.
[3] 刘盛辉，孙长林，何品刚.方禹之.分析化学，1999.
[4] 庞代文，齐义鹏，王宗礼等.化学通报[J]，l994.
[5] 方禹之，刘盛辉，何品刚.高等学校化学学报，1996.