论文部分内容阅读
摘要 [目的]探索适宜的地方山羊品种超数排卵方案。[方法]以黔北麻羊为试验动物，比较不同品牌促卵泡素（FSH）、相同品牌不同剂量FSH的超数排卵效果。[结果]41只黔北麻羊的平均黄体数14.59个，平均有效胚数8.39枚。日本产FSH 20.0 AU/只剂量组平均黄体数13.90个，平均有效胚数10.21 枚；加拿大产FSH 160 mg/只剂量组平均黄体数14.00个，平均有效胚数7.33 枚。[结论] 日本产FSH的适宜剂量为20.0 AU/只，加拿大产FSH的适宜剂量为160 mg/只，日本产FSH的超数排卵效果优于加拿大产FSH，但差异不显著。
关键词 黔北麻羊；超数排卵；促卵泡素；有效胚
中图分类号 S826 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）34-0089-03
Abstract [Objective]To explore the optimal superovulation scheme for local goats. [Method] Taking Qianbei brown goat as test amimals， the superovulation effects among different brands of FSH， same brand FSH with different dosages were compared. [Result]
The luteum （CL） number of 41 Qianbei brown goats was 14.59， the number of effective embryos was 8.39.In the group of Japanese FSH with the dose of 20.0 AU/head， the luteum （CL） number was 13.90， the number of effective embryos was 10.21.In the group of 160 mg/head FSH from Canada， the luteum （CL） number was 14.00， the number of effective embryos was 7.33. [Conclusion]The appropriate dose of FSH from Japan was 20.0 AU/head， the suitable dose of FSH from Canada was 160 mg/head， and the superovulation effect of FSH from Japan was better than that of FSH from Canada， but there was no significant difference.
Key words Qianbei brown goat；Superovulation；Folliclestimulating hormone；Effective embryo
黔北麻羊是經过长期选育的特色地方山羊品种，具有适应性强、抗病力强、耐粗饲和肉质优良等特点[1]。为了避免在发展过程中因杂交、近交、环境变化等造成的优良基因流失，开展了贵州良种黔北麻羊保种胚胎收集保存工作。利用冷冻胚胎保存动物遗传资源与其他保存技术相比具有突出的优越性，胚胎保存了品种的全部基因，若有数量充足的胚胎，可保存与现有物种遗传多样性一致的遗传资源。细胞可在超低温条件下长期保存，即使活物消失，只要存在同种物种，通过胚胎移植和核移植技术就可以恢复这些遗传资源，因此在保护动物遗传资源，尤其是挽救濒危动物方面，冷冻胚胎技术发挥着越来越重要的作用[2]。笔者比较了不同品牌FSH、同一品牌不同剂量FSH对黔北麻羊的超数排卵效果，旨在为提高黔北麻羊品种保存、良种山羊扩繁技术提供参考。
1 材料与方法
1.1 供体羊
从主产区挑选纯种优良黔北麻羊在国家肉羊产业体系贵阳综合试验站花溪区麦坪示范基地开展试验。
1.2 试验时间
2015年9—10月进行超数排卵处理、胚胎回收和胚胎冷冻保存。
1.3 主要药品与仪器
1.3.1
主要药品。日本（JP）产FSH（促卵泡素），剂量10 AU/支；加拿大（CAN）产Follitropin FSH，剂量400 mg/支；促黄体素释放激素A3（促排3号），由宁波三生药业有限公司生产，剂量20 μg/支；氯前列烯醇（PG），由上海市计划生育科学研究所生产，0.2 mg/支；普鲁卡因，由北京市永康药业有限公司生产，40 mg/支；黄体酮阴道缓释剂（CIDR），由新西兰DEC国际有限公司生产，剂量1.9 g/支。
1.3.2 主要仪器与耗材。体视显微镜、羊用二通式冲卵管、滞留针、集卵杯、恒温水浴锅、手术器械、自制手术保定架。
1.4 供体超数排卵处理方案
将供体母羊随机分成5组：① Ⅰ 组，注射日本产FSH，剂量为16.0 AU/只；② Ⅱ 组，注射日本产FSH，剂量为20.0 AU，第0天放栓，第9天开始注射，间隔12 h注射1次，注射量依次为3.6、3.2、3.0、2.6、2.4、2.0、1.8、1.4 AU/只，第5次注射时注射PG 0.2 mg/只，第7次注射时撤掉CIDR栓；③Ⅲ组，注射日本产FSH，剂量为24.0 AU/只；④Ⅳ组，注射加拿大产FSH，剂量 160 mg/只，第0天放栓，第9天开始注射，间隔12 h注射1次，注射量依次为28、24、22、22、18、18、14、14 mg/只，第5次注射时注射PG 0.2 mg/只，第7次注射时撤掉CIDR栓；⑤Ⅴ组，注射加拿大产FSH，剂量 200 mg/只。各试验组放置CIDR和配种时各注射维生素ADE注射液3 mL，撤栓时用0.9%生理盐水冲洗阴道，配种时注射促排3号3/4支。 1.5 供体羊配种
待观察到第1次站立发情12 h后配种，此后间隔10～12 h再配种1次，连续配种2～3次。
1.6 胚胎的采集与质量鉴定
以发情之日为第0天，第7天采用手术法回收胚胎。用含1%血清的杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗两侧子宫角，每侧20～30 mL 。子宫回流液静置3～5 min后在实体显微镜下捡出卵子，并保存在保存液中。根据形态学标准进行胚胎分级，通常说的有用胚胎或可移胚胎包括A、B、C级胚胎，由于保种需要，该试验中有效胚胎为A、B级胚胎。分级标准如下：
①A级。胚胎形态完整，轮廓清晰，呈球形，分裂球大小均匀，结构紧凑，色调和透明度适中，无附着的细胞和泡液，变性细胞少于15%。
②B级。轮廓清晰，色调及细胞密度良好，可见到少量附着的细胞和泡液，变性细胞少于50%。
③C级。轮廓不清晰，色调发暗，结构较为松散，游离的细胞或泡液较多，变性细胞少于75%。
④D级。16细胞以下的受精卵，或有碎片、轮廓不清晰、结构松散，变性细胞在75%以上。
1.7 数据处理
采用SPSS 17.0统计软件对试验数据进行统计分析，试验数据以“平均值±标准差”表示，采用单因素方差分析对各组数据进行差异显著性分析。超数排卵有效而冲卵失败的个体不计入个体数。
2 结果与分析
2.1 不同FSH剂量超数排卵效果的比较
由表1可知，不同剂量日本产FSH处理中，Ⅱ组超数排卵效果最佳，平均黄体数、平均卵泡发育数（黄体数与卵泡数之和）、平均回收卵数、卵子回收率、平均有效胚数、有效胚率（有效胚占回收卵的比例）分别为13.90个、14.74个、11.40个、77%、10.21枚和90%，Ⅲ组平均卵泡发育数为22.80个，极显著高于 Ⅰ 组和 Ⅱ 组（P<0.01），Ⅲ组平均卵泡数为3.60个，高于 Ⅰ 组和 Ⅱ 组（P>0.05）；Ⅰ 组和 Ⅲ 组平均回收卵数、卵子回收率、平均有效胚数、有效胚率均低于Ⅱ组，但差异均不显著（P>0.05）。由表2可知，不同剂量加拿大产FSH处理中Ⅳ组超数排卵效果最佳，平均黃体数、平均卵泡发育数、平均回收卵数、卵子回收率、平均有效胚数、有效胚率分别为14.00个、15.17个、7.67个、51%、7.33枚和96%；Ⅴ组平均卵泡发育数（17.25个）和平均回收卵数（8.50个）均高于Ⅳ组，但差异均不显著（P>0.05）；Ⅴ组卵子回收率、平均有效胚数、有效胚率均低于Ⅳ组，但差异不显著（P>0.05）。
2.2 不同品牌FSH超数排卵效果的比较
由表3可知，加拿大产FSH处理组平均卵泡发育数、有效胚率均高于日本产FSH处理组（P>0.05），但平均回收卵数、卵子回收率、平均有效胚数均低于日本产FSH处理组（P>0.05），说明日本产FSH的超数排卵效果优于加拿大产FSH。
3 讨论
超数排卵对于供体牛而言是一个复杂的生理过程，超数排卵处理方法通常是根据供体本身血清激素水平的变化而设计的，但对于不同品种、不同个体和不同药物，其处理方法也不尽相同，超数排卵结果也不一。适宜FSH剂量是获得最佳超数排卵效果的关键因素之一。若剂量过高会造成较强的激素应答反应。刘广振[3]认为较强的激素应答反应使得部分个体优势卵泡排卵过早，黄体功能不全，分泌孕酮水平较低，从而造成胚胎退化。谭景和等[4]、范必勤等[5]也认为较强的激素应答反应使得卵巢过度增大，卵泡过度增多，可能卵母细胞质量下降，排卵后卵子未进入输卵管中而直接掉入腹腔，最终卵子回收率低、未受精卵多、可用胚率也很低，A、B级胚胎更少。该试验中日本产FSH大剂量组（24.0 AU/只）、加拿大产FSH大剂量组（200 mg/只）组卵泡发育多，但回收到的卵子少，尤其是有效胚胎少，可能卵子质量差，造成受精率低和退化胚胎多。该试验证实了以上说法，同时也说明黔北麻羊适宜FSH剂量为20.0 AU/只的日本产FSH和160 mg/只的加拿大产FSH。
超数排卵所用激素不同品牌、不同批次也是影响超数排卵效果的主要因素之一。桑润滋[6]认为，不同品牌、不同批次都存在质量差异和效价不稳定，纯度及所含促黄体素（LH）活性成分的多少，以及用于不同品种、不同个体超数排卵效果也不相同。该试验中日本产FSH超数排卵效果优于加拿大FSH，但差异不显著，说明日本产FSH更适合贵州黔北麻羊，同时也建议大规模进行超数排卵前应做预试验。
4 结论
该试验中用促卵泡素处理41只贵州黔北麻羊，平均黄体数14.59个，平均获有效胚8.39 枚，日本产FSH的适宜剂量为20.0 AU/只，平均黄体数13.90个，平均回收卵数14.74个，平均获有效胚10.21 枚；加拿大产FSH的适宜剂量为160 mg/只，平均黄体数14.00个，平均回收卵数7.67个，平均获有效胚7.33 枚；日本产FSH效果优于加拿大产FSH，但差异不显著，说明日本产FSH更适合贵州黔北麻羊，同时也建议大规模进行超数排卵前应做预试验。
参考文献
[1] 国家畜禽遗传资源委员会组.中国畜禽遗传资源志：羊志[M].北京：中国农业出版社，2011：370-373.
[2] 赵永聚.动物遗传资源保护概论[M].重庆：西南师范大学出版社，2007：49-51.
[3] 刘广振.奶牛胚胎体内死亡的因素分析及预防措施[J].乳业科学与技术，2005，27（5）：225-227.
[4] 谭景和，秦鹏春.超数排卵及其存在的问题（综述）[J].黑龙江畜牧兽医，1987（5）：33-37.
[5] 范必勤，熊慧卿，邵春荣.家兔超数排卵的研究[J].中国养兔杂志，1987（1）：25-30.
[6] 桑润滋.动物繁殖生物技术[M].北京：中国农业出版社，2002：220-225.
关键词 黔北麻羊；超数排卵；促卵泡素；有效胚
中图分类号 S826 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）34-0089-03
Abstract [Objective]To explore the optimal superovulation scheme for local goats. [Method] Taking Qianbei brown goat as test amimals， the superovulation effects among different brands of FSH， same brand FSH with different dosages were compared. [Result]
The luteum （CL） number of 41 Qianbei brown goats was 14.59， the number of effective embryos was 8.39.In the group of Japanese FSH with the dose of 20.0 AU/head， the luteum （CL） number was 13.90， the number of effective embryos was 10.21.In the group of 160 mg/head FSH from Canada， the luteum （CL） number was 14.00， the number of effective embryos was 7.33. [Conclusion]The appropriate dose of FSH from Japan was 20.0 AU/head， the suitable dose of FSH from Canada was 160 mg/head， and the superovulation effect of FSH from Japan was better than that of FSH from Canada， but there was no significant difference.
Key words Qianbei brown goat；Superovulation；Folliclestimulating hormone；Effective embryo
黔北麻羊是經过长期选育的特色地方山羊品种，具有适应性强、抗病力强、耐粗饲和肉质优良等特点[1]。为了避免在发展过程中因杂交、近交、环境变化等造成的优良基因流失，开展了贵州良种黔北麻羊保种胚胎收集保存工作。利用冷冻胚胎保存动物遗传资源与其他保存技术相比具有突出的优越性，胚胎保存了品种的全部基因，若有数量充足的胚胎，可保存与现有物种遗传多样性一致的遗传资源。细胞可在超低温条件下长期保存，即使活物消失，只要存在同种物种，通过胚胎移植和核移植技术就可以恢复这些遗传资源，因此在保护动物遗传资源，尤其是挽救濒危动物方面，冷冻胚胎技术发挥着越来越重要的作用[2]。笔者比较了不同品牌FSH、同一品牌不同剂量FSH对黔北麻羊的超数排卵效果，旨在为提高黔北麻羊品种保存、良种山羊扩繁技术提供参考。
1 材料与方法
1.1 供体羊
从主产区挑选纯种优良黔北麻羊在国家肉羊产业体系贵阳综合试验站花溪区麦坪示范基地开展试验。
1.2 试验时间
2015年9—10月进行超数排卵处理、胚胎回收和胚胎冷冻保存。
1.3 主要药品与仪器
1.3.1
主要药品。日本（JP）产FSH（促卵泡素），剂量10 AU/支；加拿大（CAN）产Follitropin FSH，剂量400 mg/支；促黄体素释放激素A3（促排3号），由宁波三生药业有限公司生产，剂量20 μg/支；氯前列烯醇（PG），由上海市计划生育科学研究所生产，0.2 mg/支；普鲁卡因，由北京市永康药业有限公司生产，40 mg/支；黄体酮阴道缓释剂（CIDR），由新西兰DEC国际有限公司生产，剂量1.9 g/支。
1.3.2 主要仪器与耗材。体视显微镜、羊用二通式冲卵管、滞留针、集卵杯、恒温水浴锅、手术器械、自制手术保定架。
1.4 供体超数排卵处理方案
将供体母羊随机分成5组：① Ⅰ 组，注射日本产FSH，剂量为16.0 AU/只；② Ⅱ 组，注射日本产FSH，剂量为20.0 AU，第0天放栓，第9天开始注射，间隔12 h注射1次，注射量依次为3.6、3.2、3.0、2.6、2.4、2.0、1.8、1.4 AU/只，第5次注射时注射PG 0.2 mg/只，第7次注射时撤掉CIDR栓；③Ⅲ组，注射日本产FSH，剂量为24.0 AU/只；④Ⅳ组，注射加拿大产FSH，剂量 160 mg/只，第0天放栓，第9天开始注射，间隔12 h注射1次，注射量依次为28、24、22、22、18、18、14、14 mg/只，第5次注射时注射PG 0.2 mg/只，第7次注射时撤掉CIDR栓；⑤Ⅴ组，注射加拿大产FSH，剂量 200 mg/只。各试验组放置CIDR和配种时各注射维生素ADE注射液3 mL，撤栓时用0.9%生理盐水冲洗阴道，配种时注射促排3号3/4支。 1.5 供体羊配种
待观察到第1次站立发情12 h后配种，此后间隔10～12 h再配种1次，连续配种2～3次。
1.6 胚胎的采集与质量鉴定
以发情之日为第0天，第7天采用手术法回收胚胎。用含1%血清的杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗两侧子宫角，每侧20～30 mL 。子宫回流液静置3～5 min后在实体显微镜下捡出卵子，并保存在保存液中。根据形态学标准进行胚胎分级，通常说的有用胚胎或可移胚胎包括A、B、C级胚胎，由于保种需要，该试验中有效胚胎为A、B级胚胎。分级标准如下：
①A级。胚胎形态完整，轮廓清晰，呈球形，分裂球大小均匀，结构紧凑，色调和透明度适中，无附着的细胞和泡液，变性细胞少于15%。
②B级。轮廓清晰，色调及细胞密度良好，可见到少量附着的细胞和泡液，变性细胞少于50%。
③C级。轮廓不清晰，色调发暗，结构较为松散，游离的细胞或泡液较多，变性细胞少于75%。
④D级。16细胞以下的受精卵，或有碎片、轮廓不清晰、结构松散，变性细胞在75%以上。
1.7 数据处理
采用SPSS 17.0统计软件对试验数据进行统计分析，试验数据以“平均值±标准差”表示，采用单因素方差分析对各组数据进行差异显著性分析。超数排卵有效而冲卵失败的个体不计入个体数。
2 结果与分析
2.1 不同FSH剂量超数排卵效果的比较
由表1可知，不同剂量日本产FSH处理中，Ⅱ组超数排卵效果最佳，平均黄体数、平均卵泡发育数（黄体数与卵泡数之和）、平均回收卵数、卵子回收率、平均有效胚数、有效胚率（有效胚占回收卵的比例）分别为13.90个、14.74个、11.40个、77%、10.21枚和90%，Ⅲ组平均卵泡发育数为22.80个，极显著高于 Ⅰ 组和 Ⅱ 组（P<0.01），Ⅲ组平均卵泡数为3.60个，高于 Ⅰ 组和 Ⅱ 组（P>0.05）；Ⅰ 组和 Ⅲ 组平均回收卵数、卵子回收率、平均有效胚数、有效胚率均低于Ⅱ组，但差异均不显著（P>0.05）。由表2可知，不同剂量加拿大产FSH处理中Ⅳ组超数排卵效果最佳，平均黃体数、平均卵泡发育数、平均回收卵数、卵子回收率、平均有效胚数、有效胚率分别为14.00个、15.17个、7.67个、51%、7.33枚和96%；Ⅴ组平均卵泡发育数（17.25个）和平均回收卵数（8.50个）均高于Ⅳ组，但差异均不显著（P>0.05）；Ⅴ组卵子回收率、平均有效胚数、有效胚率均低于Ⅳ组，但差异不显著（P>0.05）。
2.2 不同品牌FSH超数排卵效果的比较
由表3可知，加拿大产FSH处理组平均卵泡发育数、有效胚率均高于日本产FSH处理组（P>0.05），但平均回收卵数、卵子回收率、平均有效胚数均低于日本产FSH处理组（P>0.05），说明日本产FSH的超数排卵效果优于加拿大产FSH。
3 讨论
超数排卵对于供体牛而言是一个复杂的生理过程，超数排卵处理方法通常是根据供体本身血清激素水平的变化而设计的，但对于不同品种、不同个体和不同药物，其处理方法也不尽相同，超数排卵结果也不一。适宜FSH剂量是获得最佳超数排卵效果的关键因素之一。若剂量过高会造成较强的激素应答反应。刘广振[3]认为较强的激素应答反应使得部分个体优势卵泡排卵过早，黄体功能不全，分泌孕酮水平较低，从而造成胚胎退化。谭景和等[4]、范必勤等[5]也认为较强的激素应答反应使得卵巢过度增大，卵泡过度增多，可能卵母细胞质量下降，排卵后卵子未进入输卵管中而直接掉入腹腔，最终卵子回收率低、未受精卵多、可用胚率也很低，A、B级胚胎更少。该试验中日本产FSH大剂量组（24.0 AU/只）、加拿大产FSH大剂量组（200 mg/只）组卵泡发育多，但回收到的卵子少，尤其是有效胚胎少，可能卵子质量差，造成受精率低和退化胚胎多。该试验证实了以上说法，同时也说明黔北麻羊适宜FSH剂量为20.0 AU/只的日本产FSH和160 mg/只的加拿大产FSH。
超数排卵所用激素不同品牌、不同批次也是影响超数排卵效果的主要因素之一。桑润滋[6]认为，不同品牌、不同批次都存在质量差异和效价不稳定，纯度及所含促黄体素（LH）活性成分的多少，以及用于不同品种、不同个体超数排卵效果也不相同。该试验中日本产FSH超数排卵效果优于加拿大FSH，但差异不显著，说明日本产FSH更适合贵州黔北麻羊，同时也建议大规模进行超数排卵前应做预试验。
4 结论
该试验中用促卵泡素处理41只贵州黔北麻羊，平均黄体数14.59个，平均获有效胚8.39 枚，日本产FSH的适宜剂量为20.0 AU/只，平均黄体数13.90个，平均回收卵数14.74个，平均获有效胚10.21 枚；加拿大产FSH的适宜剂量为160 mg/只，平均黄体数14.00个，平均回收卵数7.67个，平均获有效胚7.33 枚；日本产FSH效果优于加拿大产FSH，但差异不显著，说明日本产FSH更适合贵州黔北麻羊，同时也建议大规模进行超数排卵前应做预试验。
参考文献
[1] 国家畜禽遗传资源委员会组.中国畜禽遗传资源志：羊志[M].北京：中国农业出版社，2011：370-373.
[2] 赵永聚.动物遗传资源保护概论[M].重庆：西南师范大学出版社，2007：49-51.
[3] 刘广振.奶牛胚胎体内死亡的因素分析及预防措施[J].乳业科学与技术，2005，27（5）：225-227.
[4] 谭景和，秦鹏春.超数排卵及其存在的问题（综述）[J].黑龙江畜牧兽医，1987（5）：33-37.
[5] 范必勤，熊慧卿，邵春荣.家兔超数排卵的研究[J].中国养兔杂志，1987（1）：25-30.
[6] 桑润滋.动物繁殖生物技术[M].北京：中国农业出版社，2002：220-225.