目的 克隆去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein reeeptor,ASGPR)H1亚单位显性表位435 bp基因片段,构建表达重组质粒,进行表达、纯化,以获得具有免疫活性的ASGPR蛋白,建立间接ELISA法,并探讨其在检测自身免疫性肝炎(AIH)中抗ASGPR抗体的价值.方法 将ASGPRH1亚单位糖类识别区(CRDH1)435 bp的基因片段定向克隆至真核表达载体PEGH,经D-半乳糖诱导表达,表达产物用谷胱甘肽凝胶珠(Glutathione Sepharose4B)亲和纯化,并通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹法(WB)及蛋白质谱(MALDI-TOF)进行免疫活性鉴定,应用表达蛋白建立ELISA法.同时用该方法检测45例AIH、30例SLE、30例类风湿关节炎(RA)、10例原发性干燥综合征(SS)患者、30名健康献血者的抗ASGPR抗体阳性率.结果 经重组质粒测序结果证实,CRDHl/PEGH目的 基因已正确插入真核表达载体中,基因序列正确,符合表达框架;SDS-PAGE检测表达产物为l条相对分子质量42 500的蛋白表达条带.质谱蛋白肽指纹数据通过Mascot在人类蛋白质数据库中分析比对,与ASGPR H1亚单位蛋白同源性为98.34%,WB分析表明,重组蛋白具有人ASGPR抗原反应性;间接ELISA检测血清结果显示,AIH组中抗ASGPR抗体的阳性率为35.6%(16/45),非AIH组均为阴性,差异有统计学意义(χ2=31.85,P<0.01).结论 成功克隆的ASGPR H1基因可在啤酒酵母菌中成功表达,且重组的自身抗原具有较好的抗原性和特异性.应用纯化蛋白建_上的间接ELISA检测AIH抗ASGPR抗体具有较好的特异性。
去唾液酸糖蛋白受体H1亚单位基因片段的克隆表达及其检测自身免疫性肝炎的价值
【摘 要】
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目的 克隆去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein reeeptor,ASGPR)H1亚单位显性表位435 bp基因片段,构建表达重组质粒,进行表达、纯化,以获得具有免疫活性的ASGPR蛋白,建立间接ELISA法,并探讨其在检测自身免疫性肝炎(AIH)中抗ASGPR抗体的价值.方法 将ASGPRH1亚单位糖类识别区(CRDH1)435 bp的基因片段定向克隆至真核表达载体PEGH,
【机 构】
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100032,中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院风湿免疫科北京市顺义区医院风湿免疫科,100032,中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院风湿免疫科,中国科学院北京基因组研究所北京华大基因
【发表日期】
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2009年32期
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