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摘 要：蛋白质是人体中非常重要的组成成分。蛋白质含量测定的常用方法有凯氏定氮法、双缩脲法、酚试剂法、紫外吸收法及燃烧法等。基于此，本文对蛋白质含量的测定进行了研究。
关键词：蛋白质;分析方法;凯氏定氮法
蛋白质是构成生命的重要物质[1]。在人体的细胞和组织中，蛋白质是非常重要的组成成分。在人体中，蛋白质占了人体质量的18%，其与生命现象有着密切的关系。人体内蛋白质的种类很多，但性质和功能各有区别。因此，蛋白质的检测方法就显得尤为重要。凯氏定氮法是测定蛋白质含量最为普遍的方法，同时相比较于其他检测方式，其具有更多优势[2]，如易于操作、实验过程安全、成本较为合理、测定结果准确。因此，凯氏定氮法成为食品检验工作中普遍的测定方法。
1 实验仪器与试剂
实验仪器：电子天平（Metteler Toledo ML204）;石墨消解仪（济南海能仪器股份有限公司）;全自动凯氏定氮仪（山东海能科学仪器有限公司）。
试剂：硫酸铜;硫酸钾;硫酸;硼酸;氢氧化钠;甲基红指示剂;溴甲酚绿指示剂;95%乙醇溶液。
2 实验方法
2.1 实验原理
食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，产生的氨和硫酸结合生成硫酸铵。碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以硫酸或者盐酸标准滴定溶液滴定，根据酸的消耗量计算氮含量。凯氏定氮法的反应过程包含以下几个方面。
消化：蛋白质+浓硫酸硫酸铵+二氧化碳+二氧化硫+水
蒸馏：氢氧化钠+硫酸铵→氨气+硫酸钠+水
吸收：氨气+硼酸→硼酸铵+水
滴定：硼酸铵+水+盐酸→氯化铵+硼酸
2.2 滴定注意事项
在滴定过程中需要注意以下两点。①指示剂为甲基红溴甲酚绿，其在碱性条件下变蓝，酸性条件下暗变红。②催化定氮片。硫酸铜催化剂;硫酸钾防止暴沸。
2.3 樣品处理及实验步骤分析
①称量。固体试样0.2～2 g、半固体试样2～5 g，液体试样10～25 g。②消化。于消化管中加入硫酸铜、硫酸钾，10 mL浓硫酸后，放置石墨消解炉上消解90 min，消解温度为420 ℃，消解仪可选用曲线加热模式和直线加热模式。③上机。消解后的样品冷却后，可上机测试。上机测试前，需要对机器进行清洗，包括接受杯、碱管路，机器，清洗完毕后，先测试空白样品，再测试样品。④计算。根据公式可知，试样的质量、试剂空白滴定液体积、试样滴定液体积和氮换算为蛋白质的系数是变量，因此，实验过程中需要关注天平的准确性、消解是否完全、机器清洗是否干净、空白试剂的滴定体积数以及试验滴定液体积数是否准确。
3 仪器常规维护保养
①仪器要有良好的通风和散热条件。②仪器测试时首先进入清洗界面选择，换酸清洗3次左右，当改变滴定酸的浓度时，用换酸清洗的方法将管路及滴定器中的滴定酸排净，再用新换酸冲洗至少6次，并及时排液。③测样前连续做仪器空白测试[3]。等到仪器稳定后可测试样品（将机器中的碱量调为零，进行测试，当滴定体积之差小于0.05 mL，机器即为稳定）。④每日实验结束后，清洗接收杯1～2次以及碱管路2次，用洗瓶冲洗蒸馏头残余碱液。仪器前部的槽皿中，如果积有液体，将其擦洗干净。⑤为了延长防溅装置的使用寿命，请每天工作结束后清洗，即消化管内加入一半左右的蒸馏水（以蒸馏完成消化管液体不溢出为准），上机蒸馏，一般清洗2次左右（空蒸仪器把加碱量设置为“0”）。⑥仪器使用结束后要关闭水源、电源，仪器上要安装空消化管（防止防溅装置内残留液体流到仪器上）。⑦为防止碱路结晶影响仪器寿命，在完成实验后，进行碱管路清洗。若仪器长时间不用或者使用时间一周以上时，应将碱桶中的碱液换为蒸馏水;将消化管放好，选择手动加碱，达到清洗管路的作用，防结晶堵塞。⑧碱液桶、硼酸液桶应定期清理沉淀物并清洗干净。⑨仪器长期使用，在蒸馏瓶中会有水垢产生，将影响加热效率（建议6个月清理1次）;如使用频繁，可增加清洗频率[4]。通过加蒸馏水管路加入除垢剂或一定浓度的弱酸性溶液清洗干净，按蒸馏水排水阀排净，再用蒸馏水多次冲洗后将管路连接好。⑩如仪器存放环境温度低于零度以下应排空仪器内所有液体，以免造成仪器损坏。
4 注意事项
①实验前，试剂要准备充足，保证满足本批次实验;②开机前要打开冷却循环水，保证冷却效果;③强酸强碱反应剧烈，建议设置加10～20 mL蒸馏水进行稀释;④添加氢氧化钾溶液的体积数为浓硫酸体积的4倍，最为适宜;⑤开始进行蒸馏时，消化管中液体的总体积以不超过总体积的1/3为宜;⑥拿取消化管的过程中需要注意高温烫伤。在放置消化管时，需要左右旋转几下，确保消化管与蒸馏头密封;⑦禁止使用边缘有缺口，或者有裂缝的消化管;⑧仪器蒸馏过程中如遇紧急情况，可直接关闭电源开关;⑨排废液管的出口要比仪器安放位置低，以使排液畅通。
5 实际应用与现状
在目前检测中，食品中蛋白质含量测试参照《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》（GB 5009.5—2016）、《饲料中粗蛋白的测定 凯氏定氮法》（GB/T 6432—2018），同时，凯氏定氮仪还可以测定食品中挥发性盐基氮的含量，参照标准为GB 5009.228—2016以及测定大豆肽粉中多肽含量，参照标准为GB/T 22492—2008。凯氏定氮法测量蛋白质含量最为合适[5]。蛋白质的测定有凯氏定氮法、双缩脲法、酚试剂法、紫外吸收法和燃烧法，其具体操作及特点如下。
5.1 凯氏定氮法
准备4个50 mL凯氏烧瓶并标号，向1、2号烧瓶中加入定量的蛋白质样品，另外两个烧瓶作为对照，在每个烧瓶中加入硫酸钾-硫酸铜混合物，再加入浓硫酸，将4个烧瓶放到消化架上进行消化，之后进行蒸馏，全部蒸馏完毕后用标准盐酸滴定各烧瓶中收集的氨量，直至指示剂混合液由绿色变回淡紫红色，即为滴定终点，结算出蛋白质含量。 5.2 双缩脲法
双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法，硫铵不干扰显色，Cu2+与蛋白质的肽键以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此络合物在540 nm波长处有最大吸收。首先利用标准蛋白溶液和双缩脲试剂绘制标准曲线，将待测血清与硫酸钠在待测试管中混合[6]，并用只加入硫酸钠不含血清的试管作为对照，将两支试管加入等量的双缩脲试剂，充分混合后于37 ℃环境中放置10 min，在540 nm波长处进行比色，以对照管调零，读取吸光度值，由标准曲线上直接查出蛋白质含量。双缩脲法常用于0.5～10 g/L含量的蛋白质溶液测定。
5.3 酚试剂法
取6支试管分别标号，前5支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液，最后一支试管加待测蛋白质溶液，不加标准蛋白溶液，每支试管液体总量通过加入蒸馏水补足而保持一致，将液体混合均匀，在室温下放置30 min，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于650 nm波长处测定各管中溶液的吸光度值。
5.4 紫外吸收法
大多数蛋白质在280 nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在，可用于测定0.1～0.5 mg/mL含量的蛋白质溶液。取9支试管分别标号，前8支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液，1号试管不加标准蛋白溶液，最后一支试管加待测蛋白质溶液[7]，而不加标准蛋白溶液，每支试管液体总量通过加入蒸馏水补足而保持一致，将液体混合均匀[8]，在280 nm波长处进行比色，记录吸光度值。
5.5 燃烧法
试样在900～1 200 ℃高温下燃烧，燃烧过程中产生混合气体，其中碳、硫等干扰气体和盐类被吸收管吸收，氮氧化物被全部还原成氮气，形成的氮气气流通过热导检测器进行检测。此方法易操作[9]，但需要购买氮/蛋白质分析仪，采购费用比较昂贵。
参考文献
[1]张美娜.分光光度法在食品添加剂测定中的应用[J].粮食科技与经济，2018，43（9）：54-56.
[2]曹坎涛.蛋白质测定方法改进[J].河北化工，2011，34（10）：26-27.
[3]莫佳琳，张思原，陆海勤，等.钼酸铵分光光度法检测糖厂工业磷酸含量的应用研究[J].甘蔗糖业，2015（1）：52-56.
[4]吴贺标，张顺红.分光光度法检测的应用及分析[J].啤酒科技，2001（10）：51.
[5]李官慧.紫外-可见分光光度法在食品检测及食品安全分析中的应用[J].中国标准化，2017（22）：72-73.
[6]李婷.分光光度法在食品检测中的应用标准研究[J].中国标准化，2017（16）：57-58.
[7]郝丽红.分光光度法在食品检测中的应用标准研究[J].饮食科学，2017（14）：12.
[8]汤亚芳.分光光度法在食品添加剂测定中的应用[J].广东化工，2016，43（10）：209.
[9]董宇芳，潘临平.PAN萃取食品中錳的分光光度法的方法探讨[J].山西食品工业，1998（2）：39-40.
关键词：蛋白质;分析方法;凯氏定氮法
蛋白质是构成生命的重要物质[1]。在人体的细胞和组织中，蛋白质是非常重要的组成成分。在人体中，蛋白质占了人体质量的18%，其与生命现象有着密切的关系。人体内蛋白质的种类很多，但性质和功能各有区别。因此，蛋白质的检测方法就显得尤为重要。凯氏定氮法是测定蛋白质含量最为普遍的方法，同时相比较于其他检测方式，其具有更多优势[2]，如易于操作、实验过程安全、成本较为合理、测定结果准确。因此，凯氏定氮法成为食品检验工作中普遍的测定方法。
1 实验仪器与试剂
实验仪器：电子天平（Metteler Toledo ML204）;石墨消解仪（济南海能仪器股份有限公司）;全自动凯氏定氮仪（山东海能科学仪器有限公司）。
试剂：硫酸铜;硫酸钾;硫酸;硼酸;氢氧化钠;甲基红指示剂;溴甲酚绿指示剂;95%乙醇溶液。
2 实验方法
2.1 实验原理
食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，产生的氨和硫酸结合生成硫酸铵。碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以硫酸或者盐酸标准滴定溶液滴定，根据酸的消耗量计算氮含量。凯氏定氮法的反应过程包含以下几个方面。
消化：蛋白质+浓硫酸硫酸铵+二氧化碳+二氧化硫+水
蒸馏：氢氧化钠+硫酸铵→氨气+硫酸钠+水
吸收：氨气+硼酸→硼酸铵+水
滴定：硼酸铵+水+盐酸→氯化铵+硼酸
2.2 滴定注意事项
在滴定过程中需要注意以下两点。①指示剂为甲基红溴甲酚绿，其在碱性条件下变蓝，酸性条件下暗变红。②催化定氮片。硫酸铜催化剂;硫酸钾防止暴沸。
2.3 樣品处理及实验步骤分析
①称量。固体试样0.2～2 g、半固体试样2～5 g，液体试样10～25 g。②消化。于消化管中加入硫酸铜、硫酸钾，10 mL浓硫酸后，放置石墨消解炉上消解90 min，消解温度为420 ℃，消解仪可选用曲线加热模式和直线加热模式。③上机。消解后的样品冷却后，可上机测试。上机测试前，需要对机器进行清洗，包括接受杯、碱管路，机器，清洗完毕后，先测试空白样品，再测试样品。④计算。根据公式可知，试样的质量、试剂空白滴定液体积、试样滴定液体积和氮换算为蛋白质的系数是变量，因此，实验过程中需要关注天平的准确性、消解是否完全、机器清洗是否干净、空白试剂的滴定体积数以及试验滴定液体积数是否准确。
3 仪器常规维护保养
①仪器要有良好的通风和散热条件。②仪器测试时首先进入清洗界面选择，换酸清洗3次左右，当改变滴定酸的浓度时，用换酸清洗的方法将管路及滴定器中的滴定酸排净，再用新换酸冲洗至少6次，并及时排液。③测样前连续做仪器空白测试[3]。等到仪器稳定后可测试样品（将机器中的碱量调为零，进行测试，当滴定体积之差小于0.05 mL，机器即为稳定）。④每日实验结束后，清洗接收杯1～2次以及碱管路2次，用洗瓶冲洗蒸馏头残余碱液。仪器前部的槽皿中，如果积有液体，将其擦洗干净。⑤为了延长防溅装置的使用寿命，请每天工作结束后清洗，即消化管内加入一半左右的蒸馏水（以蒸馏完成消化管液体不溢出为准），上机蒸馏，一般清洗2次左右（空蒸仪器把加碱量设置为“0”）。⑥仪器使用结束后要关闭水源、电源，仪器上要安装空消化管（防止防溅装置内残留液体流到仪器上）。⑦为防止碱路结晶影响仪器寿命，在完成实验后，进行碱管路清洗。若仪器长时间不用或者使用时间一周以上时，应将碱桶中的碱液换为蒸馏水;将消化管放好，选择手动加碱，达到清洗管路的作用，防结晶堵塞。⑧碱液桶、硼酸液桶应定期清理沉淀物并清洗干净。⑨仪器长期使用，在蒸馏瓶中会有水垢产生，将影响加热效率（建议6个月清理1次）;如使用频繁，可增加清洗频率[4]。通过加蒸馏水管路加入除垢剂或一定浓度的弱酸性溶液清洗干净，按蒸馏水排水阀排净，再用蒸馏水多次冲洗后将管路连接好。⑩如仪器存放环境温度低于零度以下应排空仪器内所有液体，以免造成仪器损坏。
4 注意事项
①实验前，试剂要准备充足，保证满足本批次实验;②开机前要打开冷却循环水，保证冷却效果;③强酸强碱反应剧烈，建议设置加10～20 mL蒸馏水进行稀释;④添加氢氧化钾溶液的体积数为浓硫酸体积的4倍，最为适宜;⑤开始进行蒸馏时，消化管中液体的总体积以不超过总体积的1/3为宜;⑥拿取消化管的过程中需要注意高温烫伤。在放置消化管时，需要左右旋转几下，确保消化管与蒸馏头密封;⑦禁止使用边缘有缺口，或者有裂缝的消化管;⑧仪器蒸馏过程中如遇紧急情况，可直接关闭电源开关;⑨排废液管的出口要比仪器安放位置低，以使排液畅通。
5 实际应用与现状
在目前检测中，食品中蛋白质含量测试参照《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》（GB 5009.5—2016）、《饲料中粗蛋白的测定 凯氏定氮法》（GB/T 6432—2018），同时，凯氏定氮仪还可以测定食品中挥发性盐基氮的含量，参照标准为GB 5009.228—2016以及测定大豆肽粉中多肽含量，参照标准为GB/T 22492—2008。凯氏定氮法测量蛋白质含量最为合适[5]。蛋白质的测定有凯氏定氮法、双缩脲法、酚试剂法、紫外吸收法和燃烧法，其具体操作及特点如下。
5.1 凯氏定氮法
准备4个50 mL凯氏烧瓶并标号，向1、2号烧瓶中加入定量的蛋白质样品，另外两个烧瓶作为对照，在每个烧瓶中加入硫酸钾-硫酸铜混合物，再加入浓硫酸，将4个烧瓶放到消化架上进行消化，之后进行蒸馏，全部蒸馏完毕后用标准盐酸滴定各烧瓶中收集的氨量，直至指示剂混合液由绿色变回淡紫红色，即为滴定终点，结算出蛋白质含量。 5.2 双缩脲法
双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法，硫铵不干扰显色，Cu2+与蛋白质的肽键以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此络合物在540 nm波长处有最大吸收。首先利用标准蛋白溶液和双缩脲试剂绘制标准曲线，将待测血清与硫酸钠在待测试管中混合[6]，并用只加入硫酸钠不含血清的试管作为对照，将两支试管加入等量的双缩脲试剂，充分混合后于37 ℃环境中放置10 min，在540 nm波长处进行比色，以对照管调零，读取吸光度值，由标准曲线上直接查出蛋白质含量。双缩脲法常用于0.5～10 g/L含量的蛋白质溶液测定。
5.3 酚试剂法
取6支试管分别标号，前5支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液，最后一支试管加待测蛋白质溶液，不加标准蛋白溶液，每支试管液体总量通过加入蒸馏水补足而保持一致，将液体混合均匀，在室温下放置30 min，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于650 nm波长处测定各管中溶液的吸光度值。
5.4 紫外吸收法
大多数蛋白质在280 nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在，可用于测定0.1～0.5 mg/mL含量的蛋白质溶液。取9支试管分别标号，前8支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液，1号试管不加标准蛋白溶液，最后一支试管加待测蛋白质溶液[7]，而不加标准蛋白溶液，每支试管液体总量通过加入蒸馏水补足而保持一致，将液体混合均匀[8]，在280 nm波长处进行比色，记录吸光度值。
5.5 燃烧法
试样在900～1 200 ℃高温下燃烧，燃烧过程中产生混合气体，其中碳、硫等干扰气体和盐类被吸收管吸收，氮氧化物被全部还原成氮气，形成的氮气气流通过热导检测器进行检测。此方法易操作[9]，但需要购买氮/蛋白质分析仪，采购费用比较昂贵。
参考文献
[1]张美娜.分光光度法在食品添加剂测定中的应用[J].粮食科技与经济，2018，43（9）：54-56.
[2]曹坎涛.蛋白质测定方法改进[J].河北化工，2011，34（10）：26-27.
[3]莫佳琳，张思原，陆海勤，等.钼酸铵分光光度法检测糖厂工业磷酸含量的应用研究[J].甘蔗糖业，2015（1）：52-56.
[4]吴贺标，张顺红.分光光度法检测的应用及分析[J].啤酒科技，2001（10）：51.
[5]李官慧.紫外-可见分光光度法在食品检测及食品安全分析中的应用[J].中国标准化，2017（22）：72-73.
[6]李婷.分光光度法在食品检测中的应用标准研究[J].中国标准化，2017（16）：57-58.
[7]郝丽红.分光光度法在食品检测中的应用标准研究[J].饮食科学，2017（14）：12.
[8]汤亚芳.分光光度法在食品添加剂测定中的应用[J].广东化工，2016，43（10）：209.
[9]董宇芳，潘临平.PAN萃取食品中錳的分光光度法的方法探讨[J].山西食品工业，1998（2）：39-40.