【摘 要】
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目的:建立一种简便、无害的体外测定PKA激酶活性的非放射性核素方法。方法:采用RT-PCR方法从HEK293细胞的总RNA中扩增PKAα的cDNA,并将PKAα的cDNA克隆至pGEX-6p-1载体中。经
【机 构】
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中国食品药品检定研究院; 空军后勤部门诊部;
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目的:建立一种简便、无害的体外测定PKA激酶活性的非放射性核素方法。方法:采用RT-PCR方法从HEK293细胞的总RNA中扩增PKAα的cDNA,并将PKAα的cDNA克隆至pGEX-6p-1载体中。经纯化后的体外表达蛋白用免疫印迹(Western blot)法进行鉴定。最后采用非放射性核素法Kinase-Glo激酶发光检测试剂盒测定表达蛋白GST-PKAα的活性。结果:经过优化诱导条件,我们成功地纯化得到了GST-PKAα的融合蛋白。用非放射性核素法Kinase-Glo激酶发光检测试剂盒测定纯化蛋白GST-PKAα活性。我们还用PKA特异性抑制剂H-89进一步确定了表达蛋白GST-PKAα的活性,并且测定了其IC50值为(35.2±3.97)nmol/L,与报道值一致。结论:Kinase-Glo激酶发光检测法测定PKA激酶活性,操作简便、对人体无害。此方法能有效应用于临床前PKA激酶抑制剂的高通量筛选、PKA激酶新作用靶点的发现以及靶向蛋白PKA磷酸化位点的研究。
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