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摘要[目的]研究Alcalase蛋白酶对大米蛋白的水解作用以改善大米蛋白的溶解性。[方法]通过单因素试验，研究pH、温度、酶浓度、底物浓度等因素对Alcalase蛋白酶酶解大米蛋白的影响，通过正交试验确定Alcalase蛋白酶水解大米蛋白的最佳水解条件。[结果] Alcalase蛋白酶水解大米蛋白的最佳水解条件是pH 8.0、温度55 ℃、酶浓度1 200 U/g、底物浓度4%、水解时间2 h，此条件下大米蛋白的溶解度为71.25%。[结论]酶解后大米蛋白的溶解度顯著提高。
关键词大米蛋白；碱性蛋白酶；酶解；溶解度
中图分类号S609.9文献标识码A文章编号0517-6611（2014）28-09933-03
Study on Solubility Improvement of Rice Protein
HUANG Jianshao， ZHANG Hong
（School of Life Science， Hunan University of Arts and Science， Changde， Hunan 415000）
Abstract[Objective] In order to improve the solubility of rice protein， hydrolysis process for rice protein with Alcalase was studied. [Method] The effects of the main parameters including pH， hydrolysis temperature， enzyme concentration， substrate concentration， hydrolysis time on hydrolysis reaction were investigated. The optimum conditions had been found by singlefactor analysis and orthogonal test. [Result] The optimum conditions were showed as following， pH was 8.0， hydrolysing temperature was 55 ℃， enzyme concentration of substrate was 1 200 U/g， substrate concentration was 4%， hydrolysis time was 2 h， solubility of rice protein was 71.25%. [Conclusion] After enzymatic hydrolysis， the solubility of rice protein increased significantly.
Key wordsRice protein； Alcalase； Enzymatic hydrolysis； Solubility
大米蛋白是一种优质植物蛋白，它含有丰富的必需氨基酸，第1限制性氨基酸赖氨酸的含量高于其他谷类，且氨基酸组成模式与WHO/FAO的推荐模式相接近，易于被人体消化吸收。与其他谷类蛋白相比，大米蛋白的生物价（BV）和蛋白质利用率（PER）更高，在各种粮食中均居第1位。大米蛋白还具有低过敏性的特点，这使它非常适合作为婴儿或是特殊人群的蛋白补充剂[1]。但大米蛋白主要成分是谷蛋白，谷蛋白分子量大，分子内和分子之间大量存在巯基和二硫键，这些结构特性使得大米蛋白在中性条件下难溶于水，严重影响它在食品工业中的应用，因此改善大米蛋白的溶解性是解决这一问题的关键[2]。蛋白酶是具有生物催化功能的生物大分子，能够将蛋白质分子的肽链水解断裂，改善蛋白质的溶解性。
笔者采用淀粉糖生产的下脚料米渣用淀粉酶纯化制得大米蛋白，采用Alcalase蛋白酶进行酶解试验，研究酶用量、底物浓度、pH、温度等因素对大米蛋白溶解性的影响，确定Alcalase蛋白酶水解大米蛋白的工艺条件，以期改善大米蛋白的溶解性。
1材料与方法
1.1材料
米渣蛋白，由万福生科农业开发股份有限公司提供（蛋白质含量为52.5%、总糖含量为32.1%、水分含量为6.5%）。主要试剂：中温α淀粉酶（10 000 U/g）、Alcalase蛋白酶（200 000 U/g），江苏锐阳生物科技有限公司；福林酚试剂，上海荔达生物科技有限公司；酪蛋白（AR），杭州微生物试剂厂；氢氧化钠、盐酸等试剂均为分析纯。
仪器与设备：
722S紫外分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；凯氏定氮仪，长沙隆和化波仪器有限公司；H.H.S.21电热恒温水浴锅，上海医疗器械五厂；TDL40B台式离心机，上海安亭科学仪器厂；ES电子计数天平，长沙湘平科技发展有限公司；TB3型定时恒温磁力搅拌器，上海雷磁新经仪器有限公司；DELTA320pH计，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。
1.2方法
1.2.1测定项目及方法。大米蛋白和酪蛋白的蛋白质含量测定：凯氏定氮法；
可溶性氮的测定：福林酚法[3]。
1.2.2大米蛋白的制备。
采用淀粉酶脱糖法提纯制得大米蛋白。酶解条件是：固液比1∶12 g/ml、温度70 ℃、pH 6.5、加酶量30 U/g、酶解时间3 h。反应结束后酶解液调pH至4.0，沉淀物真空干燥、粉碎制得大米蛋白粉。采用淀粉酶脱糖制得的大米蛋白的蛋白质含量83.2%。
1.2.3大米蛋白的酶解反应。
配制一定浓度的大米蛋白悬浮液，调温度、pH至试验设定值，加入反应所需的酶量，并低速搅拌。在反应过程中以1.0 mol/L的NaOH维持pH恒定（±0.1 pH单位）。水解结束后立即把酶解液放入95 ℃热水中加热15 min终止反应，酶解液冷却后用1.0 mol/L HCl溶液或NaOH溶液调pH至7.0，在3 000 r/min转速下离心20 min，用福林酚法测定上清液可溶性蛋白质含量，计算大米蛋白酶解产物的溶解度[4-5]。 溶解度（%）=上清液可溶性蛋白质总量/反应体系中蛋白质总量×100
2结果与分析
2.1Alcalase蛋白酶浓度对大米蛋白溶解度的影响
酶解条件：温度50 ℃、pH 8.0、底物浓度[S]8%、酶解时间2.0 h，以酶解液的溶解度为指标，结果见图1。随着酶浓度的增加，大米蛋白酶解液的溶解度快速增加，但酶浓度大于1 200 U/g 后，溶解度的增速顯著减慢，这是因为在酶与底物作用位点达到饱和的情况下，加大酶的浓度对于酶解反应速度的影响有限。考虑到酶解效果，Alcalase蛋白酶的酶浓度选择1 200 U/g底物较为适宜。
图1Alcalase蛋白酶浓度对大米蛋白溶解度的影响
2.2大米蛋白底物浓度对大米蛋白溶解度的影响
酶解条件：温度50 ℃、pH 8.0、酶用量1 200 U/g、酶解时间2.0 h，以酶解液的溶解度为指标，结果见图2。在底物浓度较低时，大米蛋白酶解液的溶解度较高，当底物浓度超过6%以后，大米蛋白酶解液的溶解度显著下降，其原因可能是底物浓度增大后，不利于酶与底物的充分接触。因此，底物浓度在4%～6%较为适宜。
图2大米蛋白底物浓度对大米蛋白溶解度的影响
2.3酶解pH对大米蛋白溶解度的影响
酶解条件：温度50 ℃、酶用量1 200 U/g、底物浓度[S]8%、时间2.0 h，以大米蛋白酶解液的溶解度为指标，结果见图3。Alcalase蛋白酶酶解大米蛋白最适pH在7.0～9.0。
图3pH对大米蛋白酶水解产物溶解度的影响
2.4酶解温度对大米蛋白溶解度的影响
酶解条件：pH 8.0、酶用量1 200 U/g、底物浓度[S]8%、时间2.0 h，以大米蛋白酶解液的溶解度为指标，结果见图4。在酶解温度为45～55 ℃，大米蛋白的溶解度随温度的升高而增大；但温度高于60 ℃后，溶解度迅速下降。因此，Alcalase蛋白酶酶解大米蛋白的最适温度在50～60 ℃。
图4温度对大米蛋白酶水解产物的影响
2.5Alcalase蛋白酶酶解大米蛋白最佳条件的确定
采用L9（34）正交表，以大米蛋白酶解液的溶解度指标，拟定试验方案（表1）来考虑4个因素对水解度的影响，水解时间为2 h。
由正交试验结果表2可知，影响大米蛋白酶解产物溶解度的4个因素中，其影响程度大小为A>B>C> D，最优组合为A1B3C3D2，即Alcalase蛋白酶浓度为1 200 U/g，大米蛋白用量4.0%，酶解温度为55 ℃，酶解pH为8.0。在此条件下酶解2 h，大米蛋白酶解产物的溶解度为71.25%，而从表2中直观看出的最大溶解度为70.21%，故确定Alcalase酶解大米蛋白的最佳条件是Alcalase蛋白酶浓度为1 200 U/g，大米蛋白底物浓度4.0%，温度为55 ℃，pH为8.0。
2.6Alcalase蛋白酶酶解大米蛋白的水解曲线
影响大米蛋白酶解液溶解度的另一重要因素是酶解时间。在pH为8.0，温度为55 ℃，酶浓度为1 200 U/g，底物浓度为4.0%的条件下，测定Alcalase蛋白酶的水解曲线，以确定适宜的酶解时间。由图5可知，Alcalase蛋白酶对大米蛋白酶解效率高，30 min酶解液的溶解度就达57.68%，而2 h以后溶解度的增幅很小。综合考虑，Alcalase蛋白酶酶解大米蛋白的时间在2 h较为适宜。
图5Alcalase蛋白酶酶解大米蛋白的水解曲线
2.7pH对大米蛋白酶解液溶解度的影响酶解结束后，调节酶解液的pH，测定不同pH条件下溶解度的变化。从图6可知，大米蛋白用Alcalase蛋白酶酶解2 h后，溶解度大幅增加，特别是在等电点区域（pH 4）尤为显著。酶解前大米蛋白在pH 4时的溶解度仅为8.31%，而酶解后溶解度增至66.87%，溶解性能的改善将有助于拓展大米蛋白的应用领域。
3结论
采用Alcalase蛋白酶酶解大米蛋白，能有效改善大米蛋
白的溶解性。Alcalase蛋白酶水解大米蛋白的最佳条件是
图6pH对大米蛋白酶解液溶解度的影响
pH 8.0，温度55 ℃，酶浓度为1 200 U/g，底物浓度为4.0%，水解时间2 h，大米蛋白酶解液的溶解度达71.25%。
大米蛋白酶解后，溶解性显著改善，即使在大米蛋白的等电点区域仍然有很好的溶解度。
参考文献
[1] 陈正行，姚惠源，周素梅.米蛋白与米糠蛋白的开发利用[J].粮食与油脂，2002（4）：6-9.
[2] 肖莲荣，任国谱.大米蛋白改性研究进展[J].食品与发酵工业，2012，38（2）：151-155.
[3] 张龙翔，张庭芳，李令媛.生化实验方法和技术[M].2版.北京：高等教育出版社，1997.
[4] 郭荣荣，潘思轶，王可兴.碱法与酶法提取大米蛋白工艺及功能特性比较研究[J].食品科学，2005，38（3）：173-177.
[5] 王威，曾里，曾凡骏.大米浓缩蛋白限制性水解及其性质研究[J].食品研究与开发，2008，29（3）：14-17.
[6] 王章存，申瑞玲，姚惠源.大米蛋白研究进展[J].中国粮油学报，2004，19（2）：11-15.
关键词大米蛋白；碱性蛋白酶；酶解；溶解度
中图分类号S609.9文献标识码A文章编号0517-6611（2014）28-09933-03
Study on Solubility Improvement of Rice Protein
HUANG Jianshao， ZHANG Hong
（School of Life Science， Hunan University of Arts and Science， Changde， Hunan 415000）
Abstract[Objective] In order to improve the solubility of rice protein， hydrolysis process for rice protein with Alcalase was studied. [Method] The effects of the main parameters including pH， hydrolysis temperature， enzyme concentration， substrate concentration， hydrolysis time on hydrolysis reaction were investigated. The optimum conditions had been found by singlefactor analysis and orthogonal test. [Result] The optimum conditions were showed as following， pH was 8.0， hydrolysing temperature was 55 ℃， enzyme concentration of substrate was 1 200 U/g， substrate concentration was 4%， hydrolysis time was 2 h， solubility of rice protein was 71.25%. [Conclusion] After enzymatic hydrolysis， the solubility of rice protein increased significantly.
Key wordsRice protein； Alcalase； Enzymatic hydrolysis； Solubility
大米蛋白是一种优质植物蛋白，它含有丰富的必需氨基酸，第1限制性氨基酸赖氨酸的含量高于其他谷类，且氨基酸组成模式与WHO/FAO的推荐模式相接近，易于被人体消化吸收。与其他谷类蛋白相比，大米蛋白的生物价（BV）和蛋白质利用率（PER）更高，在各种粮食中均居第1位。大米蛋白还具有低过敏性的特点，这使它非常适合作为婴儿或是特殊人群的蛋白补充剂[1]。但大米蛋白主要成分是谷蛋白，谷蛋白分子量大，分子内和分子之间大量存在巯基和二硫键，这些结构特性使得大米蛋白在中性条件下难溶于水，严重影响它在食品工业中的应用，因此改善大米蛋白的溶解性是解决这一问题的关键[2]。蛋白酶是具有生物催化功能的生物大分子，能够将蛋白质分子的肽链水解断裂，改善蛋白质的溶解性。
笔者采用淀粉糖生产的下脚料米渣用淀粉酶纯化制得大米蛋白，采用Alcalase蛋白酶进行酶解试验，研究酶用量、底物浓度、pH、温度等因素对大米蛋白溶解性的影响，确定Alcalase蛋白酶水解大米蛋白的工艺条件，以期改善大米蛋白的溶解性。
1材料与方法
1.1材料
米渣蛋白，由万福生科农业开发股份有限公司提供（蛋白质含量为52.5%、总糖含量为32.1%、水分含量为6.5%）。主要试剂：中温α淀粉酶（10 000 U/g）、Alcalase蛋白酶（200 000 U/g），江苏锐阳生物科技有限公司；福林酚试剂，上海荔达生物科技有限公司；酪蛋白（AR），杭州微生物试剂厂；氢氧化钠、盐酸等试剂均为分析纯。
仪器与设备：
722S紫外分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；凯氏定氮仪，长沙隆和化波仪器有限公司；H.H.S.21电热恒温水浴锅，上海医疗器械五厂；TDL40B台式离心机，上海安亭科学仪器厂；ES电子计数天平，长沙湘平科技发展有限公司；TB3型定时恒温磁力搅拌器，上海雷磁新经仪器有限公司；DELTA320pH计，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。
1.2方法
1.2.1测定项目及方法。大米蛋白和酪蛋白的蛋白质含量测定：凯氏定氮法；
可溶性氮的测定：福林酚法[3]。
1.2.2大米蛋白的制备。
采用淀粉酶脱糖法提纯制得大米蛋白。酶解条件是：固液比1∶12 g/ml、温度70 ℃、pH 6.5、加酶量30 U/g、酶解时间3 h。反应结束后酶解液调pH至4.0，沉淀物真空干燥、粉碎制得大米蛋白粉。采用淀粉酶脱糖制得的大米蛋白的蛋白质含量83.2%。
1.2.3大米蛋白的酶解反应。
配制一定浓度的大米蛋白悬浮液，调温度、pH至试验设定值，加入反应所需的酶量，并低速搅拌。在反应过程中以1.0 mol/L的NaOH维持pH恒定（±0.1 pH单位）。水解结束后立即把酶解液放入95 ℃热水中加热15 min终止反应，酶解液冷却后用1.0 mol/L HCl溶液或NaOH溶液调pH至7.0，在3 000 r/min转速下离心20 min，用福林酚法测定上清液可溶性蛋白质含量，计算大米蛋白酶解产物的溶解度[4-5]。 溶解度（%）=上清液可溶性蛋白质总量/反应体系中蛋白质总量×100
2结果与分析
2.1Alcalase蛋白酶浓度对大米蛋白溶解度的影响
酶解条件：温度50 ℃、pH 8.0、底物浓度[S]8%、酶解时间2.0 h，以酶解液的溶解度为指标，结果见图1。随着酶浓度的增加，大米蛋白酶解液的溶解度快速增加，但酶浓度大于1 200 U/g 后，溶解度的增速顯著减慢，这是因为在酶与底物作用位点达到饱和的情况下，加大酶的浓度对于酶解反应速度的影响有限。考虑到酶解效果，Alcalase蛋白酶的酶浓度选择1 200 U/g底物较为适宜。
图1Alcalase蛋白酶浓度对大米蛋白溶解度的影响
2.2大米蛋白底物浓度对大米蛋白溶解度的影响
酶解条件：温度50 ℃、pH 8.0、酶用量1 200 U/g、酶解时间2.0 h，以酶解液的溶解度为指标，结果见图2。在底物浓度较低时，大米蛋白酶解液的溶解度较高，当底物浓度超过6%以后，大米蛋白酶解液的溶解度显著下降，其原因可能是底物浓度增大后，不利于酶与底物的充分接触。因此，底物浓度在4%～6%较为适宜。
图2大米蛋白底物浓度对大米蛋白溶解度的影响
2.3酶解pH对大米蛋白溶解度的影响
酶解条件：温度50 ℃、酶用量1 200 U/g、底物浓度[S]8%、时间2.0 h，以大米蛋白酶解液的溶解度为指标，结果见图3。Alcalase蛋白酶酶解大米蛋白最适pH在7.0～9.0。
图3pH对大米蛋白酶水解产物溶解度的影响
2.4酶解温度对大米蛋白溶解度的影响
酶解条件：pH 8.0、酶用量1 200 U/g、底物浓度[S]8%、时间2.0 h，以大米蛋白酶解液的溶解度为指标，结果见图4。在酶解温度为45～55 ℃，大米蛋白的溶解度随温度的升高而增大；但温度高于60 ℃后，溶解度迅速下降。因此，Alcalase蛋白酶酶解大米蛋白的最适温度在50～60 ℃。
图4温度对大米蛋白酶水解产物的影响
2.5Alcalase蛋白酶酶解大米蛋白最佳条件的确定
采用L9（34）正交表，以大米蛋白酶解液的溶解度指标，拟定试验方案（表1）来考虑4个因素对水解度的影响，水解时间为2 h。
由正交试验结果表2可知，影响大米蛋白酶解产物溶解度的4个因素中，其影响程度大小为A>B>C> D，最优组合为A1B3C3D2，即Alcalase蛋白酶浓度为1 200 U/g，大米蛋白用量4.0%，酶解温度为55 ℃，酶解pH为8.0。在此条件下酶解2 h，大米蛋白酶解产物的溶解度为71.25%，而从表2中直观看出的最大溶解度为70.21%，故确定Alcalase酶解大米蛋白的最佳条件是Alcalase蛋白酶浓度为1 200 U/g，大米蛋白底物浓度4.0%，温度为55 ℃，pH为8.0。
2.6Alcalase蛋白酶酶解大米蛋白的水解曲线
影响大米蛋白酶解液溶解度的另一重要因素是酶解时间。在pH为8.0，温度为55 ℃，酶浓度为1 200 U/g，底物浓度为4.0%的条件下，测定Alcalase蛋白酶的水解曲线，以确定适宜的酶解时间。由图5可知，Alcalase蛋白酶对大米蛋白酶解效率高，30 min酶解液的溶解度就达57.68%，而2 h以后溶解度的增幅很小。综合考虑，Alcalase蛋白酶酶解大米蛋白的时间在2 h较为适宜。
图5Alcalase蛋白酶酶解大米蛋白的水解曲线
2.7pH对大米蛋白酶解液溶解度的影响酶解结束后，调节酶解液的pH，测定不同pH条件下溶解度的变化。从图6可知，大米蛋白用Alcalase蛋白酶酶解2 h后，溶解度大幅增加，特别是在等电点区域（pH 4）尤为显著。酶解前大米蛋白在pH 4时的溶解度仅为8.31%，而酶解后溶解度增至66.87%，溶解性能的改善将有助于拓展大米蛋白的应用领域。
3结论
采用Alcalase蛋白酶酶解大米蛋白，能有效改善大米蛋
白的溶解性。Alcalase蛋白酶水解大米蛋白的最佳条件是
图6pH对大米蛋白酶解液溶解度的影响
pH 8.0，温度55 ℃，酶浓度为1 200 U/g，底物浓度为4.0%，水解时间2 h，大米蛋白酶解液的溶解度达71.25%。
大米蛋白酶解后，溶解性显著改善，即使在大米蛋白的等电点区域仍然有很好的溶解度。
参考文献
[1] 陈正行，姚惠源，周素梅.米蛋白与米糠蛋白的开发利用[J].粮食与油脂，2002（4）：6-9.
[2] 肖莲荣，任国谱.大米蛋白改性研究进展[J].食品与发酵工业，2012，38（2）：151-155.
[3] 张龙翔，张庭芳，李令媛.生化实验方法和技术[M].2版.北京：高等教育出版社，1997.
[4] 郭荣荣，潘思轶，王可兴.碱法与酶法提取大米蛋白工艺及功能特性比较研究[J].食品科学，2005，38（3）：173-177.
[5] 王威，曾里，曾凡骏.大米浓缩蛋白限制性水解及其性质研究[J].食品研究与开发，2008，29（3）：14-17.
[6] 王章存，申瑞玲，姚惠源.大米蛋白研究进展[J].中国粮油学报，2004，19（2）：11-15.