论文部分内容阅读
[摘要] 目的 探討长链非编码RNA（lncRNA）尿路上皮癌相关基因1（UCA1）在食管鳞癌中表达及其对癌细胞黏附和迁移影响。
方法 以我院接受手术治疗的52例食管鳞癌病人作为研究对象，取原发灶处部分癌组织及距离原发灶边缘3～5 cm的癌旁组织，检测两者lncRNA UCA1表达水平及其对食管癌细胞侵袭和迁移能力的影响。
结果 PCR检测表明，原发灶癌组织的UCA1表达水平为（1.52±0.56） HU，癌旁组织为（0.95±0.36） HU，两者比较差异有显著性（t=6.174，P<0.01）。低表达UCA1基因能够抑制食管鳞癌细胞Eca109、KYSE170的迁移能力和侵袭能力，过表达UCA1基因能促进食管鳞癌细胞TE1和TE13的迁移能力和侵袭能力，差异均有显著性（F=133.00～1 252.32，P<0.01）。
结论 lncRNA UCA1能够促进食管癌细胞侵袭和迁移，通过影响细胞周期而影响癌细胞的增殖。
[关键词] 食管鳞状细胞癌;RNA，长链非编码;尿路上皮癌相关基因1;肿瘤侵润;肿瘤转移
[中图分类号] R735.1;R342.2
[文献标志码] A
[文章编号] 2096-5532（2020）03-0355-04
doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.103
[开放科学（资源服务）标识码（OSID）]
[网络出版] http：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200528.0827.002.html;2020-05-28 11：45
EXPRESSION OF THE LONG NON-CODING RNA UROTHELIAL CARCINOMA ASSOCIATED 1 IN ESOPHAGEAL SQUAMOUS CELL CARCINOMA AND ITS EFFECT ON THE ADHESION AND MIGRATION OF CANCER CELLS
WANG Xian， WANG Haibing
（Department of Chest Surgery， Clinical Medical College， Henan University of Science and Technology （The First Aff-
iliated Hospital of Henan University of Science and Technology）， Luoyang 471000， China）
[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the expression of the long non-coding RNA （lncRNA） urothelial carcinoma asso-
ciated 1 （UCA1） in esophageal squamous cell carcinoma and its effect on the adhesion and migration of cancer cells.
MethodsA total of 52 patients with esophageal squamous cell carcinoma who underwent surgical treatment in our hospital were enrolled as subjects. The cancerous tissue of primary lesion and the adjacent tissue 3-5 cm away from the edge of the primary lesion were collected to measure the expression of the lncRNA UCA1 and observe its effect on the invasion and migration abilities of esophageal cancer cells.
ResultsThe results of PCR showed that there was a significant difference in the expression of UCA1 between the tissue of primary lesion and the adjacent tissue （（1.52±0.56） HU vs （0.95±0.36） HU;t=6.174，P<0.01）. Low expression of UCA1 inhibited migration and invasion abilities of esophageal squamous cell carcinoma cells Eca109 and KYSE170， while overexpression of UCA1 promoted the migration and invasion abilities of esophageal squamous cell carcinoma cells TE1 and TE13 （F=133.00-1 252.32，P<0.01）.
ConclusionThe lncRNA UCA1 can promote the invasion and migration of esophageal cancer cells and affect cell proliferation by influencing cell cycle. [KEY WORDS]esophageal squamous cell carcinoma; RNA， long noncoding; urothelial carcinoma associated 1; neoplasm invasiveness; neoplasm metastasis
食管癌发病是由多种因素共同作用的结果，随着基因高通量测序技术的发展，长链非编码RNA（lncRNA）被认为在多种癌症发展中扮演重要角色[1-2]。已有研究结果表明，lncRNA参与人体细胞增殖、分化、转移、凋亡等生物学活动，其在多种恶性肿瘤发展中也发挥作用[3-6]。尿路上皮癌相关基因1（UCA1）是癌症调节耐药基因，参与多种肿瘤的恶性发展[7-12]，如胃癌、肺癌、直肠癌等。UCA1是一种来源于人类内源性逆转录病毒（HERV-H）家族的lncRNA分子，其基因定位于人类第19号染色体（19p13.12），全长为1.4 kb。lncRNA UCA1最初在膀胱癌被发现，并能够促进肿瘤细胞增殖和转移[13]。目前，lncRNA UCA1在食管癌中表达及其作用研究报道较少。本文对lncRNA UCA1在食管鳞癌中表达及其对癌细胞黏附和迁移的调控进行分析，探讨lncRNA UCA1用于食管鳞癌病人早期诊断及术后监测的临床价值。现将结果报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
2016年5月—2018年5月，收集在本院接受手术治疗的52例食管鳞癌病人作为研究对象，男性28例，女性24例，年龄48～72岁，平均（62.8±7.6）岁。纳入标准：所有病人均经术后组织病理检查证实为食管鳞癌，手术前均未给予化疗及放疗处理。排除标准：肝肾功能异常、免疫缺陷、其他恶性肿瘤，以及并发高血压、糖尿病等全身系统疾病者。该组病人均自愿接受手术，对本次研究均知情同意。本研究经过我院医学伦理委员会批准。
1.2 仪器和试剂
1.2.1 主要仪器 全自动组织包埋机（日本樱花集团）;光学显微镜（日本OLYMPUS公司）;实时荧光定量PCR（qRCR）仪（CFX96型，美国Bio-Rad公司）;Eppendorf Research移液器（德国Eppendorf公司）;台式低温超速离心机（德国Eppendorf公司）;-80 ℃冰箱（美国Thermo公司）;CO2培养箱（美国Thermo公司）等。
1.2.2 主要试剂 苏木精-伊红（HE）染色试剂盒（索莱宝（中国）公司），Trizol试剂盒（美国Invitrogen公司），All-in-OneTM miRNA qRT-PCR Detection kit（美国Gene Copoeia公司），PCR扩增引物、DEPC水（生工生物工程（上海）技术有限公司），氯仿、异丙醇、无水乙醇（中国国药集团），胎牛血清（德国PAN公司），2.5 g/L的胰蛋白酶、青霉素/链霉素注射液（新赛美生物科技有限公司），人食管鳞癌细胞系Eca109、KYSE170、KYSE150、KYSE9706、KYSE30、TE1和TE13（上海弘顺生物科技有限公司），质粒si-uca1、si-nc和pc-dna-uca1（上海吉凯基因化学技术有限公司合成）。
1.3 实验方法
1.3.1 标本获取及处理 取病人原发灶处部分癌组织及距离原发灶边缘3～5 cm正常组织。标本切除后立即分为两部分：一部分在新鲜状态下用RNA保存液保存以提取RNA;另一部分用40 g/L甲醛溶液固定，做成蜡块保存，用于HE染色。
1.3.2 lncRNA UCA1表达的qPCR检测 Trizol法提取总RNA，采用qPCR两步法进行检测。设计lncRNA UCA1引物，然后使用反转录试剂盒进行反转录得到cDNA，配制qPCR反应体系，设置反应程序（95 ℃预变性 10 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s）进行qPCR扩增。通过软件得到Ct值，单位为HU。
1.3.3 食管癌细胞迁移和侵袭实验 采用划痕试验和Transwell侵襲实验分别检测UCA1基因对食管癌细胞迁移能力和侵袭能力的影响。构建表达载体并提取重组质粒，对重组质粒si-UCA1/pc-DNA UCA1进行鉴定，随后进行大量的提取和纯化，测定其浓度和纯度，保存备用。将重组质粒进行转染，转染后提取RNA进行荧光定量验证转染效率。以肿瘤细胞膜着色判断为阳性，根据阳性细胞数及阳性细胞染色强度判断基因表达结果，其中≥3+为过表达，<3+为低表达。按操作说明进行划痕试验，在倒置显微镜下观察划痕后0、12、24 h的划痕间距，计算细胞迁移率。根据操作说明进行Transwell侵袭实验，计数透过人工基底膜的细胞数。
1.4 统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件进行分析，计量资料数据以±s表示，计数资料以百分数表示。两组间比较采用t检验和χ2检验，两组以上比较采用F检验。以P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 癌组织和癌细胞UCA1表达
食管鳞癌组织和癌旁组织的HE染色见图1。qPCR结果表明，原发灶癌组织中UCA1的Ct值为（1.52±0.56） HU，癌旁组织为（0.95±0.36） HU，两者比较差异有显著意义（t=6.174，P<0.01）。UCA1在人食管癌细胞系中的相对表达量分别为：Eca109（0.61±0.08）、KYSE170（0.52±0.11）、KYSE150（0.31±0.05）、KYSE9706（0.29±0.19）、KYSE30（0.28±0.18）、TE1（0.21±0.11）和TE13（0.22±0.12），均明显高于正常食管上皮细胞NE1（0.07±0.03），差异具有统计学意义（F=107.26，P<0.01）。并且Eca109、KYSE170细胞中UCA1表达相对较高，而在TE1和TE13细胞中UCA1的表达较其他细胞系低。因此，选择代表性的食管癌细胞系Eca109、KYSE170、TE1和TE13进行后续相关的研究。 2.2 UCA1表达对食管癌细胞迁移影响
在12和24 h细胞的划痕间距百分比结果表明，与Eca109及KYSE170細胞比较，过表达UCA1基因明显抑制食管癌细胞系TE1和TE13迁移能力，差异有统计学意义（F=187.38～243.88，P<0.01）;与TE1和TE13细胞比较，低表达UCA1基因能够明显促进食管癌细胞系Eca109和KYSE170的迁移能力，差异也有统计学意义（F=133.00～1 252.32，P<0.01）。见表1。
2.3 UCA1表达对食管癌细胞侵袭影响
UCA1过表达的TE1和TE13细胞能够透过人工基底膜的数量明显高于Eca109和KYSE170，差异有统计学意义（F=1 388.68，P<0.01）。提示UCA1基因的过度表达显著促进了TE1和TE13食管癌细胞系的侵袭性。UCA1低表达的Eca109和KYSE170细胞透过人工基底膜的数量明显低于TE1和TE13，差异有统计学意义（F=426.20，P<0.01）。提示UCA1基因的低表达显著抑制了食管癌细胞系Eca109和KYSE170的侵袭性。见表2。
3 讨论
lncRNAs能够在表观遗传学、转录调控和转录后调控等不同水平上调控基因表达。国外的研究结果显示，lncRNAs的异常表达在各种恶性肿瘤的发生过程中起着重要作用[14-17]。肿瘤的发生是原癌基因激活、抑癌基因失活和细胞的永生化等过程所致，正常细胞有完善调控系统使有抑癌作用和致癌作用lncRNAs处于动态平衡，而在肿瘤细胞中这种平衡被打破。研究显示，UCA1在多种肿瘤的发生中发挥作用，如胃癌、胰腺癌和宫颈癌等[18-21]。
本文对UCA1在食管鳞癌中的表达水平及其对肿瘤细胞的迁移、黏附调控作用进行探讨。qPCR结果表明，原发灶癌组织中UCA1的Ct值明显高于癌旁非肿瘤组织，说明肿瘤组织中的UCA1表达水平明显升高，这与已有报道结果相符[22-24]。说明UCA1与食管癌的发生有一定关系，提示UCA1有可能作为食管癌的肿瘤标志物。
肿瘤细胞发生侵袭和转移涉及细胞外基质的降解和上皮细胞-间充质转化（EMT），细胞间黏附破坏对上皮可塑性的维持非常重要，该过程由钙黏蛋白介导，这已被证实是癌症的最初事件[25]。在肿瘤的发展过程中，细胞黏附破坏是一个重要的侵袭和转移事件。本文对UCA1表达在食管鳞癌细胞侵袭和迁移中的影响进行观察，研究结果显示，低表达UCA1可抑制Eca109和KYSE170细胞迁移能力，过表达UCA1促进了TE1和TE13细胞迁移能力;低表达UCA1抑制了Eca109和KYSE170细胞的侵袭能力，过表达UCA1促进了TE1和TE13细胞侵袭能力。这表明过表达的UCA1可以促进食管鳞癌细胞的迁移、侵袭能力，反之，干扰UCA1则起到相反的作用。国外通过流式细胞术分析显示，低表达UCA1基因可以上调EMT相关转录因子E-cadherin的表达，下调N-cadherin、Snail和Vimentin的表达，抑制食管癌细胞的迁移和侵袭能力;过表达UCA1基因可以下调EMT相关转录因子E-cadherin的表达，上调N-cadherin、Snail和Vimentin的表达，促进食管癌细胞的迁移和侵袭能力[26]。
综上所述，lncRNA UCA1在食管鳞癌呈高表达水平，促进食管癌细胞侵袭和迁移能力，抑制了食管癌细胞凋亡。本研究同时也证实，血清lncRNA UCA1可作为食管鳞癌病人诊断的新型潜在的循环肿瘤标志物，值得临床推广应用。
[参考文献]
[1]YAO G L， PAN C F， XU H， et al. Long noncoding RNA RP11-766N7.4 functions as a tumor suppressor by regulating epithelial-mesenchymal transition in esophageal squamous cell carcinoma [J]. Biomed Pharmacother， 2017，88（5）：778-785.
[2]闫素真，杜鲁涛，王丽丽，等. 血清lncRNA UCA1在食管鳞癌的表达及临床意义[J]. 山东大学学报（医学版）， 2018，56（6）：41-46.
[3]吴璇，邝钢，任利兵，等. 长链非编码RNA ZNF667-AS1在食管鳞状细胞癌组织中的表达及其DNA甲基化状态的研究[J]. 肿瘤防治研究， 2018，45（12）：976-980.
[4]曹巍，闫明，吴伟，等. 食管鳞状细胞癌特异相关长链非编码RNA转录物1在食管鳞状细胞癌中的表达及预后意义[J]. 中华消化杂志， 2018，38（6）：365-370.
[5]LU C， YANG L， CHEN H， et al. Upregulated long non-coding RNA BC032469 enhances carcinogenesis and metastasis of esophageal squamous cell carcinoma through regulating hTERT expression[J]. Tumor Biology， 2016，37（12）：16065-16075.
[6]方海云，高丰厚. 循环长链非编码RNA在消化道肿瘤中的研究进展[J]. 现代肿瘤医学， 2017，25（13）：2160-2163.
[7]林姜鑫，王伟伟，王莉，等. 长链非编码RNA（linc02471）对食管鳞状细胞癌细胞增殖和侵袭的影响[J]. 中国卫生检验杂志， 2018，28（5）：516-519. [8]江楠，田海华，潘金昌，等. 循环长链非编码RNA作为生物标志物在肿瘤分子诊断中的应用[J]. 生物工程学报， 2017，33（6）：910-922.
[9]GUO W， DONG Z， SHI Y， et al. Aberrant methylation-me-
diated downregulation of long noncoding RNA LOC100130476 correlates with malignant progression of esophageal squamous cell carcinoma[J]. Digestive and Liver Disease， 2016，48（8）：961-969.
[10]WANG Chaojie， ZHU Chunchao， XU Jia， et al. The lncRNA UCA1 promotes proliferation， migration， immune escape and inhibits apoptosis in gastric cancer by sponging anti-tumor miRNAs[J]. BioMed Central， 2019，18（1）：257-261.
[11]LI Yucheng， XIN Jiang， SUN Wencai. LncRNA urothelial carcinoma-associated 1 （UCA1） regulates rat bone marrow mesenchymal stem cell differentiation and promotes repair of bone defects[J]. American Scientific Publishers， 2019，9（10）：1125-1138.
[12]HUANG Zhi， ZHAO Xuya， WU Xiaowen， et al. LncRNA UCA1 facilitated cell growth and invasion through the miR-206/CLOCK axis in glioma[J]. BioMed Central， 2019，19（3）：783-796.
[13]张继威，蔡璐莹，夏舜尧，等. 长链非编码RNA在肾癌中的研究进展[J]. 临床与病理杂志， 2019，39（11）：2532-2537.
[14]韩建秋，郝丽惠，邢雅玲，等. 长链非编码RNA UCA1通过激活PI3K/Akt途径降低人宫颈癌SiHa细胞放射敏感性[J/OL]. 现代妇产科进展， 2020（4）：263-266[2020-04-30]. https：//doi.org/10.13283/j.cnki.xdfckjz.2020.04.033.
[15]YU Rucui， ZHANG Yan， LU Zhihui， et al. Long-chain non-coding RNA UCA1 inhibits renal tubular epithelial cell apoptosis by targeting microRNA-206 in diabetic nephropathy[J]. Pubmed， 2019，8（5）：1835-1847.
[16]张丹，李万军，李曾. lncRNA UCA1通过抑制miRNA-203a对乳腺癌细胞化疗耐药作用的影响[J]. 癌症进展， 2019，17（14）：1656-1658+1663.
[17]杨毅，陈林. 多发性骨髓瘤的lncRNA研究进展[J]. 中国临床研究， 2019，32（07）：996-998.
[18]施光清，马李杰，张庭秀，等. 长链非编码RNA： UCA1在恶性肿瘤中的表达和功能研究进展[J]. 西南军医， 2019，21（4）：332-336.
[19]田建海，李晓娟，郭怀远，等. 膀胱癌组织中UCA1、miR-141的表达及临床意义[J]. 中国医药导报， 2019，16（20）：121-124.
[20]宋小青，王革玲. 血清长链非编码RNA H19、ATB和UCA1在宫颈癌的差异表达及相关性分析[J]. 国际检验医学杂志， 2019，40（12）：1480-1485.
[21]刘春丽，康维亭. 长链非编码RNA对泌尿系统肿瘤耐药性的影响研究进展[J]. 济宁医学院学报， 2019，42（3）：196-200.
[22]蔡静静，周永春. 长链非编码RNA尿路上皮癌胚抗原1在实体瘤中的作用和机制[J]. 中国医药， 2019，14（4）：637-640.
[23]向万平，谭望，姚林，等. 长链非编码RNA在胃癌耐药中研究进展[J]. 四川医学， 2019，40（3）：306-309.
[24]徐晋珩，刘丽云，鄢丽敏，等. 长链非编码RNA UCA1对微卫星不稳定的人类结肠癌细胞侵袭和迁移能力的影响[J]. 中国老年学杂志， 2018，38（19）：4770-4774.
[25]曹衛刚，杨振林. 肿瘤微环境与上皮-间质转化在肿瘤转移中的研究进展[J]. 肿瘤基础与临床， 2019，32（6）：547-549.
[26]徐文品，焦琨，张伟. 长链非编码RNAs在口腔鳞癌中的研究进展[J]. 实用肿瘤学杂志， 2018，32（3）：258-262.
（本文编辑 于国艺）
[收稿日期]2019-08-27; [修订日期]2020-04-17
[基金项目]河南省医学科技攻关计划项目（201603169）
[第一作者]王献（1982-），男，硕士，主治医师。
[通信作者]王海兵（1965-），男，硕士，主任医师，E-mail：[email protected]。
方法 以我院接受手术治疗的52例食管鳞癌病人作为研究对象，取原发灶处部分癌组织及距离原发灶边缘3～5 cm的癌旁组织，检测两者lncRNA UCA1表达水平及其对食管癌细胞侵袭和迁移能力的影响。
结果 PCR检测表明，原发灶癌组织的UCA1表达水平为（1.52±0.56） HU，癌旁组织为（0.95±0.36） HU，两者比较差异有显著性（t=6.174，P<0.01）。低表达UCA1基因能够抑制食管鳞癌细胞Eca109、KYSE170的迁移能力和侵袭能力，过表达UCA1基因能促进食管鳞癌细胞TE1和TE13的迁移能力和侵袭能力，差异均有显著性（F=133.00～1 252.32，P<0.01）。
结论 lncRNA UCA1能够促进食管癌细胞侵袭和迁移，通过影响细胞周期而影响癌细胞的增殖。
[关键词] 食管鳞状细胞癌;RNA，长链非编码;尿路上皮癌相关基因1;肿瘤侵润;肿瘤转移
[中图分类号] R735.1;R342.2
[文献标志码] A
[文章编号] 2096-5532（2020）03-0355-04
doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.103
[开放科学（资源服务）标识码（OSID）]
[网络出版] http：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200528.0827.002.html;2020-05-28 11：45
EXPRESSION OF THE LONG NON-CODING RNA UROTHELIAL CARCINOMA ASSOCIATED 1 IN ESOPHAGEAL SQUAMOUS CELL CARCINOMA AND ITS EFFECT ON THE ADHESION AND MIGRATION OF CANCER CELLS
WANG Xian， WANG Haibing
（Department of Chest Surgery， Clinical Medical College， Henan University of Science and Technology （The First Aff-
iliated Hospital of Henan University of Science and Technology）， Luoyang 471000， China）
[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the expression of the long non-coding RNA （lncRNA） urothelial carcinoma asso-
ciated 1 （UCA1） in esophageal squamous cell carcinoma and its effect on the adhesion and migration of cancer cells.
MethodsA total of 52 patients with esophageal squamous cell carcinoma who underwent surgical treatment in our hospital were enrolled as subjects. The cancerous tissue of primary lesion and the adjacent tissue 3-5 cm away from the edge of the primary lesion were collected to measure the expression of the lncRNA UCA1 and observe its effect on the invasion and migration abilities of esophageal cancer cells.
ResultsThe results of PCR showed that there was a significant difference in the expression of UCA1 between the tissue of primary lesion and the adjacent tissue （（1.52±0.56） HU vs （0.95±0.36） HU;t=6.174，P<0.01）. Low expression of UCA1 inhibited migration and invasion abilities of esophageal squamous cell carcinoma cells Eca109 and KYSE170， while overexpression of UCA1 promoted the migration and invasion abilities of esophageal squamous cell carcinoma cells TE1 and TE13 （F=133.00-1 252.32，P<0.01）.
ConclusionThe lncRNA UCA1 can promote the invasion and migration of esophageal cancer cells and affect cell proliferation by influencing cell cycle. [KEY WORDS]esophageal squamous cell carcinoma; RNA， long noncoding; urothelial carcinoma associated 1; neoplasm invasiveness; neoplasm metastasis
食管癌发病是由多种因素共同作用的结果，随着基因高通量测序技术的发展，长链非编码RNA（lncRNA）被认为在多种癌症发展中扮演重要角色[1-2]。已有研究结果表明，lncRNA参与人体细胞增殖、分化、转移、凋亡等生物学活动，其在多种恶性肿瘤发展中也发挥作用[3-6]。尿路上皮癌相关基因1（UCA1）是癌症调节耐药基因，参与多种肿瘤的恶性发展[7-12]，如胃癌、肺癌、直肠癌等。UCA1是一种来源于人类内源性逆转录病毒（HERV-H）家族的lncRNA分子，其基因定位于人类第19号染色体（19p13.12），全长为1.4 kb。lncRNA UCA1最初在膀胱癌被发现，并能够促进肿瘤细胞增殖和转移[13]。目前，lncRNA UCA1在食管癌中表达及其作用研究报道较少。本文对lncRNA UCA1在食管鳞癌中表达及其对癌细胞黏附和迁移的调控进行分析，探讨lncRNA UCA1用于食管鳞癌病人早期诊断及术后监测的临床价值。现将结果报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
2016年5月—2018年5月，收集在本院接受手术治疗的52例食管鳞癌病人作为研究对象，男性28例，女性24例，年龄48～72岁，平均（62.8±7.6）岁。纳入标准：所有病人均经术后组织病理检查证实为食管鳞癌，手术前均未给予化疗及放疗处理。排除标准：肝肾功能异常、免疫缺陷、其他恶性肿瘤，以及并发高血压、糖尿病等全身系统疾病者。该组病人均自愿接受手术，对本次研究均知情同意。本研究经过我院医学伦理委员会批准。
1.2 仪器和试剂
1.2.1 主要仪器 全自动组织包埋机（日本樱花集团）;光学显微镜（日本OLYMPUS公司）;实时荧光定量PCR（qRCR）仪（CFX96型，美国Bio-Rad公司）;Eppendorf Research移液器（德国Eppendorf公司）;台式低温超速离心机（德国Eppendorf公司）;-80 ℃冰箱（美国Thermo公司）;CO2培养箱（美国Thermo公司）等。
1.2.2 主要试剂 苏木精-伊红（HE）染色试剂盒（索莱宝（中国）公司），Trizol试剂盒（美国Invitrogen公司），All-in-OneTM miRNA qRT-PCR Detection kit（美国Gene Copoeia公司），PCR扩增引物、DEPC水（生工生物工程（上海）技术有限公司），氯仿、异丙醇、无水乙醇（中国国药集团），胎牛血清（德国PAN公司），2.5 g/L的胰蛋白酶、青霉素/链霉素注射液（新赛美生物科技有限公司），人食管鳞癌细胞系Eca109、KYSE170、KYSE150、KYSE9706、KYSE30、TE1和TE13（上海弘顺生物科技有限公司），质粒si-uca1、si-nc和pc-dna-uca1（上海吉凯基因化学技术有限公司合成）。
1.3 实验方法
1.3.1 标本获取及处理 取病人原发灶处部分癌组织及距离原发灶边缘3～5 cm正常组织。标本切除后立即分为两部分：一部分在新鲜状态下用RNA保存液保存以提取RNA;另一部分用40 g/L甲醛溶液固定，做成蜡块保存，用于HE染色。
1.3.2 lncRNA UCA1表达的qPCR检测 Trizol法提取总RNA，采用qPCR两步法进行检测。设计lncRNA UCA1引物，然后使用反转录试剂盒进行反转录得到cDNA，配制qPCR反应体系，设置反应程序（95 ℃预变性 10 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s）进行qPCR扩增。通过软件得到Ct值，单位为HU。
1.3.3 食管癌细胞迁移和侵袭实验 采用划痕试验和Transwell侵襲实验分别检测UCA1基因对食管癌细胞迁移能力和侵袭能力的影响。构建表达载体并提取重组质粒，对重组质粒si-UCA1/pc-DNA UCA1进行鉴定，随后进行大量的提取和纯化，测定其浓度和纯度，保存备用。将重组质粒进行转染，转染后提取RNA进行荧光定量验证转染效率。以肿瘤细胞膜着色判断为阳性，根据阳性细胞数及阳性细胞染色强度判断基因表达结果，其中≥3+为过表达，<3+为低表达。按操作说明进行划痕试验，在倒置显微镜下观察划痕后0、12、24 h的划痕间距，计算细胞迁移率。根据操作说明进行Transwell侵袭实验，计数透过人工基底膜的细胞数。
1.4 统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件进行分析，计量资料数据以±s表示，计数资料以百分数表示。两组间比较采用t检验和χ2检验，两组以上比较采用F检验。以P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 癌组织和癌细胞UCA1表达
食管鳞癌组织和癌旁组织的HE染色见图1。qPCR结果表明，原发灶癌组织中UCA1的Ct值为（1.52±0.56） HU，癌旁组织为（0.95±0.36） HU，两者比较差异有显著意义（t=6.174，P<0.01）。UCA1在人食管癌细胞系中的相对表达量分别为：Eca109（0.61±0.08）、KYSE170（0.52±0.11）、KYSE150（0.31±0.05）、KYSE9706（0.29±0.19）、KYSE30（0.28±0.18）、TE1（0.21±0.11）和TE13（0.22±0.12），均明显高于正常食管上皮细胞NE1（0.07±0.03），差异具有统计学意义（F=107.26，P<0.01）。并且Eca109、KYSE170细胞中UCA1表达相对较高，而在TE1和TE13细胞中UCA1的表达较其他细胞系低。因此，选择代表性的食管癌细胞系Eca109、KYSE170、TE1和TE13进行后续相关的研究。 2.2 UCA1表达对食管癌细胞迁移影响
在12和24 h细胞的划痕间距百分比结果表明，与Eca109及KYSE170細胞比较，过表达UCA1基因明显抑制食管癌细胞系TE1和TE13迁移能力，差异有统计学意义（F=187.38～243.88，P<0.01）;与TE1和TE13细胞比较，低表达UCA1基因能够明显促进食管癌细胞系Eca109和KYSE170的迁移能力，差异也有统计学意义（F=133.00～1 252.32，P<0.01）。见表1。
2.3 UCA1表达对食管癌细胞侵袭影响
UCA1过表达的TE1和TE13细胞能够透过人工基底膜的数量明显高于Eca109和KYSE170，差异有统计学意义（F=1 388.68，P<0.01）。提示UCA1基因的过度表达显著促进了TE1和TE13食管癌细胞系的侵袭性。UCA1低表达的Eca109和KYSE170细胞透过人工基底膜的数量明显低于TE1和TE13，差异有统计学意义（F=426.20，P<0.01）。提示UCA1基因的低表达显著抑制了食管癌细胞系Eca109和KYSE170的侵袭性。见表2。
3 讨论
lncRNAs能够在表观遗传学、转录调控和转录后调控等不同水平上调控基因表达。国外的研究结果显示，lncRNAs的异常表达在各种恶性肿瘤的发生过程中起着重要作用[14-17]。肿瘤的发生是原癌基因激活、抑癌基因失活和细胞的永生化等过程所致，正常细胞有完善调控系统使有抑癌作用和致癌作用lncRNAs处于动态平衡，而在肿瘤细胞中这种平衡被打破。研究显示，UCA1在多种肿瘤的发生中发挥作用，如胃癌、胰腺癌和宫颈癌等[18-21]。
本文对UCA1在食管鳞癌中的表达水平及其对肿瘤细胞的迁移、黏附调控作用进行探讨。qPCR结果表明，原发灶癌组织中UCA1的Ct值明显高于癌旁非肿瘤组织，说明肿瘤组织中的UCA1表达水平明显升高，这与已有报道结果相符[22-24]。说明UCA1与食管癌的发生有一定关系，提示UCA1有可能作为食管癌的肿瘤标志物。
肿瘤细胞发生侵袭和转移涉及细胞外基质的降解和上皮细胞-间充质转化（EMT），细胞间黏附破坏对上皮可塑性的维持非常重要，该过程由钙黏蛋白介导，这已被证实是癌症的最初事件[25]。在肿瘤的发展过程中，细胞黏附破坏是一个重要的侵袭和转移事件。本文对UCA1表达在食管鳞癌细胞侵袭和迁移中的影响进行观察，研究结果显示，低表达UCA1可抑制Eca109和KYSE170细胞迁移能力，过表达UCA1促进了TE1和TE13细胞迁移能力;低表达UCA1抑制了Eca109和KYSE170细胞的侵袭能力，过表达UCA1促进了TE1和TE13细胞侵袭能力。这表明过表达的UCA1可以促进食管鳞癌细胞的迁移、侵袭能力，反之，干扰UCA1则起到相反的作用。国外通过流式细胞术分析显示，低表达UCA1基因可以上调EMT相关转录因子E-cadherin的表达，下调N-cadherin、Snail和Vimentin的表达，抑制食管癌细胞的迁移和侵袭能力;过表达UCA1基因可以下调EMT相关转录因子E-cadherin的表达，上调N-cadherin、Snail和Vimentin的表达，促进食管癌细胞的迁移和侵袭能力[26]。
综上所述，lncRNA UCA1在食管鳞癌呈高表达水平，促进食管癌细胞侵袭和迁移能力，抑制了食管癌细胞凋亡。本研究同时也证实，血清lncRNA UCA1可作为食管鳞癌病人诊断的新型潜在的循环肿瘤标志物，值得临床推广应用。
[参考文献]
[1]YAO G L， PAN C F， XU H， et al. Long noncoding RNA RP11-766N7.4 functions as a tumor suppressor by regulating epithelial-mesenchymal transition in esophageal squamous cell carcinoma [J]. Biomed Pharmacother， 2017，88（5）：778-785.
[2]闫素真，杜鲁涛，王丽丽，等. 血清lncRNA UCA1在食管鳞癌的表达及临床意义[J]. 山东大学学报（医学版）， 2018，56（6）：41-46.
[3]吴璇，邝钢，任利兵，等. 长链非编码RNA ZNF667-AS1在食管鳞状细胞癌组织中的表达及其DNA甲基化状态的研究[J]. 肿瘤防治研究， 2018，45（12）：976-980.
[4]曹巍，闫明，吴伟，等. 食管鳞状细胞癌特异相关长链非编码RNA转录物1在食管鳞状细胞癌中的表达及预后意义[J]. 中华消化杂志， 2018，38（6）：365-370.
[5]LU C， YANG L， CHEN H， et al. Upregulated long non-coding RNA BC032469 enhances carcinogenesis and metastasis of esophageal squamous cell carcinoma through regulating hTERT expression[J]. Tumor Biology， 2016，37（12）：16065-16075.
[6]方海云，高丰厚. 循环长链非编码RNA在消化道肿瘤中的研究进展[J]. 现代肿瘤医学， 2017，25（13）：2160-2163.
[7]林姜鑫，王伟伟，王莉，等. 长链非编码RNA（linc02471）对食管鳞状细胞癌细胞增殖和侵袭的影响[J]. 中国卫生检验杂志， 2018，28（5）：516-519. [8]江楠，田海华，潘金昌，等. 循环长链非编码RNA作为生物标志物在肿瘤分子诊断中的应用[J]. 生物工程学报， 2017，33（6）：910-922.
[9]GUO W， DONG Z， SHI Y， et al. Aberrant methylation-me-
diated downregulation of long noncoding RNA LOC100130476 correlates with malignant progression of esophageal squamous cell carcinoma[J]. Digestive and Liver Disease， 2016，48（8）：961-969.
[10]WANG Chaojie， ZHU Chunchao， XU Jia， et al. The lncRNA UCA1 promotes proliferation， migration， immune escape and inhibits apoptosis in gastric cancer by sponging anti-tumor miRNAs[J]. BioMed Central， 2019，18（1）：257-261.
[11]LI Yucheng， XIN Jiang， SUN Wencai. LncRNA urothelial carcinoma-associated 1 （UCA1） regulates rat bone marrow mesenchymal stem cell differentiation and promotes repair of bone defects[J]. American Scientific Publishers， 2019，9（10）：1125-1138.
[12]HUANG Zhi， ZHAO Xuya， WU Xiaowen， et al. LncRNA UCA1 facilitated cell growth and invasion through the miR-206/CLOCK axis in glioma[J]. BioMed Central， 2019，19（3）：783-796.
[13]张继威，蔡璐莹，夏舜尧，等. 长链非编码RNA在肾癌中的研究进展[J]. 临床与病理杂志， 2019，39（11）：2532-2537.
[14]韩建秋，郝丽惠，邢雅玲，等. 长链非编码RNA UCA1通过激活PI3K/Akt途径降低人宫颈癌SiHa细胞放射敏感性[J/OL]. 现代妇产科进展， 2020（4）：263-266[2020-04-30]. https：//doi.org/10.13283/j.cnki.xdfckjz.2020.04.033.
[15]YU Rucui， ZHANG Yan， LU Zhihui， et al. Long-chain non-coding RNA UCA1 inhibits renal tubular epithelial cell apoptosis by targeting microRNA-206 in diabetic nephropathy[J]. Pubmed， 2019，8（5）：1835-1847.
[16]张丹，李万军，李曾. lncRNA UCA1通过抑制miRNA-203a对乳腺癌细胞化疗耐药作用的影响[J]. 癌症进展， 2019，17（14）：1656-1658+1663.
[17]杨毅，陈林. 多发性骨髓瘤的lncRNA研究进展[J]. 中国临床研究， 2019，32（07）：996-998.
[18]施光清，马李杰，张庭秀，等. 长链非编码RNA： UCA1在恶性肿瘤中的表达和功能研究进展[J]. 西南军医， 2019，21（4）：332-336.
[19]田建海，李晓娟，郭怀远，等. 膀胱癌组织中UCA1、miR-141的表达及临床意义[J]. 中国医药导报， 2019，16（20）：121-124.
[20]宋小青，王革玲. 血清长链非编码RNA H19、ATB和UCA1在宫颈癌的差异表达及相关性分析[J]. 国际检验医学杂志， 2019，40（12）：1480-1485.
[21]刘春丽，康维亭. 长链非编码RNA对泌尿系统肿瘤耐药性的影响研究进展[J]. 济宁医学院学报， 2019，42（3）：196-200.
[22]蔡静静，周永春. 长链非编码RNA尿路上皮癌胚抗原1在实体瘤中的作用和机制[J]. 中国医药， 2019，14（4）：637-640.
[23]向万平，谭望，姚林，等. 长链非编码RNA在胃癌耐药中研究进展[J]. 四川医学， 2019，40（3）：306-309.
[24]徐晋珩，刘丽云，鄢丽敏，等. 长链非编码RNA UCA1对微卫星不稳定的人类结肠癌细胞侵袭和迁移能力的影响[J]. 中国老年学杂志， 2018，38（19）：4770-4774.
[25]曹衛刚，杨振林. 肿瘤微环境与上皮-间质转化在肿瘤转移中的研究进展[J]. 肿瘤基础与临床， 2019，32（6）：547-549.
[26]徐文品，焦琨，张伟. 长链非编码RNAs在口腔鳞癌中的研究进展[J]. 实用肿瘤学杂志， 2018，32（3）：258-262.
（本文编辑 于国艺）
[收稿日期]2019-08-27; [修订日期]2020-04-17
[基金项目]河南省医学科技攻关计划项目（201603169）
[第一作者]王献（1982-），男，硕士，主治医师。
[通信作者]王海兵（1965-），男，硕士，主任医师，E-mail：[email protected]。