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【摘要】 目的 对一例进行性对称性红斑角化症（Progressive symmetric erythrokeratodermia，PSEK）患者GJB2、GJB3、GJB4、GJB6、GJA1及SERPINB7基因突变进行检测。
方法 采用聚合酶反应（PCR）扩增GJB2、GJB3、GJB4、GJB6、GJA1及SERPINB基因所有的外显子及其邻近的剪切点并进行直接测序。
结果 PSEK患者的GJB2基因存在杂合突变，核苷酸序列第608位发生错义突变，碱基由T突变成C，GJB2基因编码的蛋白第203位的异亮氨酸转换成苏氨酸突变；GJB3、GJB4、GJA1、GJB6及SERPINB基因未发现突变；患者家庭成员未发现GJB2基因突变。
结论 GJB2基因突变可能是该例PSEK患者的致病基因。
【关键词】 进行性对称性红斑角化症；GJB2；基因；突变
中图分类号：R758.61 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2017.03.004
【Abstract】 Objective To detect GJB2，GJB3，GJB4，GJB6，GJA1 and SERPINGB7 gene mutation in a case of progressive symmetric erythrokeratodermia（PSEK）.
Methods Polymerase chain reaction （PCR） was used to amplify all exons and adjacent shearing points of GJB2，GJB3，GJB4，GJB6，GJA1 and SERPINB genes，and they were sequenced directly.
Results Heterozygous mutations existed in the GJB2 gene of PSEK patients，and base changed from T to C.A missense mutation occurred at the 608th nucleotide sequence.The 203rd isoleucine converted into threonine mutant in protein encoded by GJB2 gene.And no mutations were found in GJB3，GJB4，GJA1，GJB6 and SERPINB genes，and no mutations in GJB2 gene were found in patient’s family members.
Conclusion Mutations in the GJB2 gene may be the causative gene in patient with PSEK.
【Key words】 PSEK；GJB2；gene；mutation
紅斑角化症是皮肤科少见的单基因皮肤病，主要有两种临床亚型：（1）进行性对称性红斑角化症（OMIM：602036；Progressive symmetric erythrokeratodermia，PSEK）；（2）可变性红斑角化症（OMIM：133200；Erythrokeratodermia variabilis，EKV）[1～3]。1911年，Darier首次报道并命名PSEK，PSEK又称Gottron综合征，是一种常染色体显性遗传病，但约有半数病例为散发病例，患儿出生时正常，一般在生后数月内发病，亦有延迟至17岁时发病。皮疹为红色角化性红斑或斑块，对称分布，好发于手掌、足跖、手腕、手足背、肘、踝、膝、臀和脸部等，一般无自觉症状与系统表现。病理学特征为轻度表皮增生伴致密角化过度和角化不全，可出现毛囊角栓，棘层增厚。本研究报道1例PSEK，测序发现该患者GJB2基因2号外显子发生错义突变c.608 T>C（Ile203Thr），现将结果报道如下。
1 资料与方法
1.1 临床资料
收集PSEK患者家系所有成员4人。先证者，男，16岁，2岁时于双手掌、足底出现对称性红斑。当时未予处理，10岁时，皮疹开始增多，表现为对称性红斑、角化性斑丘疹、斑块、脱屑，伴有异味，累及双手掌、足底、手指等（图1A，B）。冬天与夏天无明显变化。真菌镜检未发现菌丝和孢子。患者足底取材行组织病理学检查：表皮网篮状角化过度，颗粒层和棘层增厚；真皮浅层可见少量淋病细胞浸润（图1C）。透射电镜示基底层细胞间隙增大（图1D）。先证者父母是非近亲婚配，父母和弟弟无类似临床症状。
1.2 实验方法
（1）采集患者、家系成员及100例健康对照者的静脉血4 ml，用EDTA二钾盐抗凝。按照QIAGEN试剂盒操作规程抽提基因组DNA。（2）用Primer 5.0软件设计能够扩增GJB2、GJB3、GJB4、GJB6、GJA1及SERPINB7基因所有编码外显子和邻近的剪切位点引物，扩增反应所需的引物的序列见表1。（3）PCR反应体系和扩增条件：PCR总反应体系为30 μL，包括10×缓冲液3 μL，正向与反向引物各1 μL，20 ng基因组DNA，2 μL dNTPs和0.2 μL Taq，模板2 μL，H2O 20.8 μL。PCR反应参数：预变性：96℃ 5 min；变性96℃ 20 s；退火55℃之间 3 min；延伸72℃ 1 min；最后终端延伸72℃ 5 min。（4）GJB2、GJB3、GJB4、GJB6、GJA1及SERPINB7基因突变分析。纯化产物后用ABI 3730（Applied Biosystem）型DNA测序仪进行测序。PCR反应进行30个循环。 2 结 果
PESK家系GJB2基因测序结果显示，患者的GJB2基因核苷酸序列第608位发生错义突变，碱基由T突变成C，GJB2基因编码的蛋白第203位的异亮氨酸转换成苏氨酸突变（p.Ile203Thr）。见图2A。PESK家系无临床表现者、100例正常对照者未发现GJB2p.Ile203Thr突变。见图2B。该患者的GJB2突变为新生突变。PESK家系所有成员未检测出GJB3、GJB4、GJB6、GJA1及SERPINB7基因突变。
3 讨 论
PSEK的病因及发病机制目前尚未阐明。1997年Ishida-Yamamoto等的研究认为LOR是PSEK的致病基因[4～5]，但Richard等对LOR基因是PSEK的致病基因提出质疑，认为Ishida-Yamamoto等报道中患者的临床诊断可能是Vohwinkel综合征的鱼鳞病亚型而非PSEK[6]。目前的研究显示：EKV发病相关的基因还有连接蛋白30.3（Cx30.3）基因及连接蛋白31（Cx31）基因[2，7]。这些研究提示PSEK具有遗传异质性。
本例患者的临床表现为手掌、足底、手指等部位红斑、斑块伴角化，临床符合PSEK，家系成员未发现类似临床表型，组织病理学显示致密的网篮状角化过度，颗粒层、棘层增厚，真皮浅层可见少量炎症细胞浸润，透视电镜示基底层细胞间隙增大，病理和超微病理表现符合PSEK。先证者的临床及组织病理与Nagashima型掌跖角化症表现相似[4～5]，Nagashima型掌跖角化症是由SERPINB7基因突变引起[9]，我们对SERPINB7基因7个编码外显子测序，未发现变异位点，排除了Nagashima型掌跖角化症的诊断。进一步对隙缝连接蛋白GJB2、GJB3、GJB4、GJB6及GJA1基因进行测序分析，发现GJB2基因核苷酸序列第608位发生错义突变，堿基由T突变成C，GJB2基因编码的蛋白第203位的异亮氨酸转换成苏氨酸突变，未发现GJB3、GJB4、GJB6、GJA1及SERPINB7基因突变位点。患者父母和弟弟未发现GJB2 p.Ile203Thr突变位点，该突变位点与家系临床表型共分离，因此，可以考虑该突变在该家系中起作用，该患者为新生突变。编码连接蛋白26（Connexin 26，Cx26）的GJB2基因，有2个细胞膜外区，在内耳和皮肤组织均有表达。GJB2基因的突变会导致内耳和皮肤功能的损害，例如GJB2基因突变可以导致聋哑症伴掌跖角化症和KID综合征[10～14]。
我们虽然确诊了该例患者，但是尚未找到很好的治疗方法，维甲酸类药物如他扎罗汀及激素软膏复方氟米松软膏能改善患者的皮损，但停药后容易复发，该类患者的治疗有待进一步研究。
参 考 文 献
[1] 郭碧蓉，方红芳，朱启明，等.进行性对称性红斑角化症的临床和遗传特征分析[J].安徽医药，2014，18（8）：1446-1449.
[2] Akman A，Masse M，Mihci E，et al.Progressive symmetrical erythrokeratoderma：report of a Turkish family and evaluation for loricrin and connexin gene mutations[J].Clin Exp Dermatol，2008，33（5）：582-584.
[3] Stnescu L，Georgescu CV，Georgescu AC，et al.Erythrokeratodermia variabilis-variant with circumscribed variable erythema and periorificial fixed Bazex Dupre erythema[J].Rom J Morphol Embryol，2007，48（4）：443-447.
[4] Ishida-Yamamoto A，Mc Grath JA，Lam H，et al.The molecular pathology of progressive symmetric erythrokeratoderma：a frameshift mutation in the loricrin gene and perturbations in the cornified cell envelope[J].Am J Hum Genet，1997，61（3）：581-589.
[5] Suga Y，Jarnik M，Attar PS，et al.Transgenic mice expressing a mutant form of loricrin reveal the molecular basis of the skin diseases，Vohwinkel syndrome and progressive symmetric erythrokeratoderma[J].J Cell Biol，2000，151（2）：401-412.
[6] Richard G，Brown N，Rouan F，et al.Genetic heterogeneity in erythrokeratodermia variabilis：novel mutations in the connexin gene GJB4 （Cx30.3） and genotype-phenotype correlations[J].J Invest Dermatol，2003，120（4）：601-609.
[7] Guo BR，Sun LD，Cui Y，et al.Progressive symmetrical erythrokeratoderma：report of two Chinese families and evaluation for mutations in the loricrin，connexin 30.3 and connexin 31 genes[J].Clin Exp Dermatol，2013，38（8）：925-927. [8] Wang W，Liu LH，Chen G，et al.A missense mutation in the GJB3 gene responsible for erythrokeratodermia variabilis in a Chinese family[J].Clin Exp Dermatol，2012，37（8）：919-921.
[9] Richard G，White TW，Smith LE，et al.Functional defects of Cx26 resulting from a heterozygous missense mutation in a family with dominant deaf-mutism and palmoplantar keratoderma[J].Hum Genet，1998，103（4）：393-399.
[10] Yin J，Xu G，Wang H，et al.New and recurrent SERPINB7 mutations in seven Chinese patients with Nagashima-type palmoplantar keratosis[J].J Invest Dermatol，2014，134（8）：2269-2272.
[11] van Steensel MA，van Geel M，Nahuys M，et al.A novel connexin 26 mutation in a patient diagnosed with keratitis-ichthyosis-deafness syndrome[J].J Invest Dermatol，2002，118（4）：724-727.
[12] Richard G，Rouan F，Willoughby CE，et al.Missense mutations in GJB2 encoding connexin-26 cause the ectodermal dysplasia keratitis-ichthyosis-deafness syndrome[J].Am J Hum Genet，2002，70（5）：1341-1348.
[13] 張锡宝，魏生才，王艳芳，等.角膜炎、鱼鳞病、耳聋综合征的GJB2基因突变研究[J].中华皮肤科杂志，2006，39（3）：146-148.
[14] Zhang XB，Wei SC，Li CX，et al.Mutation of GJB2 in a Chinese patient with keratitis-ichthyosis-deafness syndrome and brain malformation[J].Clin Exp Dermatol，2009，34（3）：309-313.
（收稿日期：2017-04-10 修回日期：2017-04-28）
（编辑：潘明志）
方法 采用聚合酶反应（PCR）扩增GJB2、GJB3、GJB4、GJB6、GJA1及SERPINB基因所有的外显子及其邻近的剪切点并进行直接测序。
结果 PSEK患者的GJB2基因存在杂合突变，核苷酸序列第608位发生错义突变，碱基由T突变成C，GJB2基因编码的蛋白第203位的异亮氨酸转换成苏氨酸突变；GJB3、GJB4、GJA1、GJB6及SERPINB基因未发现突变；患者家庭成员未发现GJB2基因突变。
结论 GJB2基因突变可能是该例PSEK患者的致病基因。
【关键词】 进行性对称性红斑角化症；GJB2；基因；突变
中图分类号：R758.61 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2017.03.004
【Abstract】 Objective To detect GJB2，GJB3，GJB4，GJB6，GJA1 and SERPINGB7 gene mutation in a case of progressive symmetric erythrokeratodermia（PSEK）.
Methods Polymerase chain reaction （PCR） was used to amplify all exons and adjacent shearing points of GJB2，GJB3，GJB4，GJB6，GJA1 and SERPINB genes，and they were sequenced directly.
Results Heterozygous mutations existed in the GJB2 gene of PSEK patients，and base changed from T to C.A missense mutation occurred at the 608th nucleotide sequence.The 203rd isoleucine converted into threonine mutant in protein encoded by GJB2 gene.And no mutations were found in GJB3，GJB4，GJA1，GJB6 and SERPINB genes，and no mutations in GJB2 gene were found in patient’s family members.
Conclusion Mutations in the GJB2 gene may be the causative gene in patient with PSEK.
【Key words】 PSEK；GJB2；gene；mutation
紅斑角化症是皮肤科少见的单基因皮肤病，主要有两种临床亚型：（1）进行性对称性红斑角化症（OMIM：602036；Progressive symmetric erythrokeratodermia，PSEK）；（2）可变性红斑角化症（OMIM：133200；Erythrokeratodermia variabilis，EKV）[1～3]。1911年，Darier首次报道并命名PSEK，PSEK又称Gottron综合征，是一种常染色体显性遗传病，但约有半数病例为散发病例，患儿出生时正常，一般在生后数月内发病，亦有延迟至17岁时发病。皮疹为红色角化性红斑或斑块，对称分布，好发于手掌、足跖、手腕、手足背、肘、踝、膝、臀和脸部等，一般无自觉症状与系统表现。病理学特征为轻度表皮增生伴致密角化过度和角化不全，可出现毛囊角栓，棘层增厚。本研究报道1例PSEK，测序发现该患者GJB2基因2号外显子发生错义突变c.608 T>C（Ile203Thr），现将结果报道如下。
1 资料与方法
1.1 临床资料
收集PSEK患者家系所有成员4人。先证者，男，16岁，2岁时于双手掌、足底出现对称性红斑。当时未予处理，10岁时，皮疹开始增多，表现为对称性红斑、角化性斑丘疹、斑块、脱屑，伴有异味，累及双手掌、足底、手指等（图1A，B）。冬天与夏天无明显变化。真菌镜检未发现菌丝和孢子。患者足底取材行组织病理学检查：表皮网篮状角化过度，颗粒层和棘层增厚；真皮浅层可见少量淋病细胞浸润（图1C）。透射电镜示基底层细胞间隙增大（图1D）。先证者父母是非近亲婚配，父母和弟弟无类似临床症状。
1.2 实验方法
（1）采集患者、家系成员及100例健康对照者的静脉血4 ml，用EDTA二钾盐抗凝。按照QIAGEN试剂盒操作规程抽提基因组DNA。（2）用Primer 5.0软件设计能够扩增GJB2、GJB3、GJB4、GJB6、GJA1及SERPINB7基因所有编码外显子和邻近的剪切位点引物，扩增反应所需的引物的序列见表1。（3）PCR反应体系和扩增条件：PCR总反应体系为30 μL，包括10×缓冲液3 μL，正向与反向引物各1 μL，20 ng基因组DNA，2 μL dNTPs和0.2 μL Taq，模板2 μL，H2O 20.8 μL。PCR反应参数：预变性：96℃ 5 min；变性96℃ 20 s；退火55℃之间 3 min；延伸72℃ 1 min；最后终端延伸72℃ 5 min。（4）GJB2、GJB3、GJB4、GJB6、GJA1及SERPINB7基因突变分析。纯化产物后用ABI 3730（Applied Biosystem）型DNA测序仪进行测序。PCR反应进行30个循环。 2 结 果
PESK家系GJB2基因测序结果显示，患者的GJB2基因核苷酸序列第608位发生错义突变，碱基由T突变成C，GJB2基因编码的蛋白第203位的异亮氨酸转换成苏氨酸突变（p.Ile203Thr）。见图2A。PESK家系无临床表现者、100例正常对照者未发现GJB2p.Ile203Thr突变。见图2B。该患者的GJB2突变为新生突变。PESK家系所有成员未检测出GJB3、GJB4、GJB6、GJA1及SERPINB7基因突变。
3 讨 论
PSEK的病因及发病机制目前尚未阐明。1997年Ishida-Yamamoto等的研究认为LOR是PSEK的致病基因[4～5]，但Richard等对LOR基因是PSEK的致病基因提出质疑，认为Ishida-Yamamoto等报道中患者的临床诊断可能是Vohwinkel综合征的鱼鳞病亚型而非PSEK[6]。目前的研究显示：EKV发病相关的基因还有连接蛋白30.3（Cx30.3）基因及连接蛋白31（Cx31）基因[2，7]。这些研究提示PSEK具有遗传异质性。
本例患者的临床表现为手掌、足底、手指等部位红斑、斑块伴角化，临床符合PSEK，家系成员未发现类似临床表型，组织病理学显示致密的网篮状角化过度，颗粒层、棘层增厚，真皮浅层可见少量炎症细胞浸润，透视电镜示基底层细胞间隙增大，病理和超微病理表现符合PSEK。先证者的临床及组织病理与Nagashima型掌跖角化症表现相似[4～5]，Nagashima型掌跖角化症是由SERPINB7基因突变引起[9]，我们对SERPINB7基因7个编码外显子测序，未发现变异位点，排除了Nagashima型掌跖角化症的诊断。进一步对隙缝连接蛋白GJB2、GJB3、GJB4、GJB6及GJA1基因进行测序分析，发现GJB2基因核苷酸序列第608位发生错义突变，堿基由T突变成C，GJB2基因编码的蛋白第203位的异亮氨酸转换成苏氨酸突变，未发现GJB3、GJB4、GJB6、GJA1及SERPINB7基因突变位点。患者父母和弟弟未发现GJB2 p.Ile203Thr突变位点，该突变位点与家系临床表型共分离，因此，可以考虑该突变在该家系中起作用，该患者为新生突变。编码连接蛋白26（Connexin 26，Cx26）的GJB2基因，有2个细胞膜外区，在内耳和皮肤组织均有表达。GJB2基因的突变会导致内耳和皮肤功能的损害，例如GJB2基因突变可以导致聋哑症伴掌跖角化症和KID综合征[10～14]。
我们虽然确诊了该例患者，但是尚未找到很好的治疗方法，维甲酸类药物如他扎罗汀及激素软膏复方氟米松软膏能改善患者的皮损，但停药后容易复发，该类患者的治疗有待进一步研究。
参 考 文 献
[1] 郭碧蓉，方红芳，朱启明，等.进行性对称性红斑角化症的临床和遗传特征分析[J].安徽医药，2014，18（8）：1446-1449.
[2] Akman A，Masse M，Mihci E，et al.Progressive symmetrical erythrokeratoderma：report of a Turkish family and evaluation for loricrin and connexin gene mutations[J].Clin Exp Dermatol，2008，33（5）：582-584.
[3] Stnescu L，Georgescu CV，Georgescu AC，et al.Erythrokeratodermia variabilis-variant with circumscribed variable erythema and periorificial fixed Bazex Dupre erythema[J].Rom J Morphol Embryol，2007，48（4）：443-447.
[4] Ishida-Yamamoto A，Mc Grath JA，Lam H，et al.The molecular pathology of progressive symmetric erythrokeratoderma：a frameshift mutation in the loricrin gene and perturbations in the cornified cell envelope[J].Am J Hum Genet，1997，61（3）：581-589.
[5] Suga Y，Jarnik M，Attar PS，et al.Transgenic mice expressing a mutant form of loricrin reveal the molecular basis of the skin diseases，Vohwinkel syndrome and progressive symmetric erythrokeratoderma[J].J Cell Biol，2000，151（2）：401-412.
[6] Richard G，Brown N，Rouan F，et al.Genetic heterogeneity in erythrokeratodermia variabilis：novel mutations in the connexin gene GJB4 （Cx30.3） and genotype-phenotype correlations[J].J Invest Dermatol，2003，120（4）：601-609.
[7] Guo BR，Sun LD，Cui Y，et al.Progressive symmetrical erythrokeratoderma：report of two Chinese families and evaluation for mutations in the loricrin，connexin 30.3 and connexin 31 genes[J].Clin Exp Dermatol，2013，38（8）：925-927. [8] Wang W，Liu LH，Chen G，et al.A missense mutation in the GJB3 gene responsible for erythrokeratodermia variabilis in a Chinese family[J].Clin Exp Dermatol，2012，37（8）：919-921.
[9] Richard G，White TW，Smith LE，et al.Functional defects of Cx26 resulting from a heterozygous missense mutation in a family with dominant deaf-mutism and palmoplantar keratoderma[J].Hum Genet，1998，103（4）：393-399.
[10] Yin J，Xu G，Wang H，et al.New and recurrent SERPINB7 mutations in seven Chinese patients with Nagashima-type palmoplantar keratosis[J].J Invest Dermatol，2014，134（8）：2269-2272.
[11] van Steensel MA，van Geel M，Nahuys M，et al.A novel connexin 26 mutation in a patient diagnosed with keratitis-ichthyosis-deafness syndrome[J].J Invest Dermatol，2002，118（4）：724-727.
[12] Richard G，Rouan F，Willoughby CE，et al.Missense mutations in GJB2 encoding connexin-26 cause the ectodermal dysplasia keratitis-ichthyosis-deafness syndrome[J].Am J Hum Genet，2002，70（5）：1341-1348.
[13] 張锡宝，魏生才，王艳芳，等.角膜炎、鱼鳞病、耳聋综合征的GJB2基因突变研究[J].中华皮肤科杂志，2006，39（3）：146-148.
[14] Zhang XB，Wei SC，Li CX，et al.Mutation of GJB2 in a Chinese patient with keratitis-ichthyosis-deafness syndrome and brain malformation[J].Clin Exp Dermatol，2009，34（3）：309-313.
（收稿日期：2017-04-10 修回日期：2017-04-28）
（编辑：潘明志）