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植物与植食性昆虫在长期协同进化过程中形成了复杂的互作关系：昆虫通过植物的生理和化学信号寻找寄主、取食和产卵，植物自身为抵抗昆虫的为害相应地形成了多种防御体系，包括生理防御（通过长刺、延长表皮毛和加厚表皮等）和化学防御（利用次生代谢物）[1]。近年来，因化学农药用于害虫防治带来的诸多环境安全问题，以植物次生代谢物为主的化学防御引起了学者的广泛关注[1]。随着现代分子生物学技术的发展，通过研究上述防御机制，人们获得了多种植物源的抗虫基因，并逐步用于害虫防治[2]。烟草是世界上重要的经济作物，由于病虫害的大量发生，化学农药的使用量不断上升，这在一定程度上控制住了虫害的发生，但长期大量使用农药带来了一系列问题，例如农药残留和环境污染等，因此挖掘抗虫基因防治烟草害虫成为害虫防治的一种重要手段。多年来，研究者已证明烟草可产生一系列相关化学物质而具有一定的抗虫性[3-7]。但在烟草抗虫基因方面的研究还较少，主要集中在蛋白酶抑制剂基因、防御物质合成基因和信号途径基因等方面。
1 蛋白酶抑制剂基因
植物蛋白酶抑制剂（proteinase inhibitor， PI）是一类能抑制蛋白酶活性的小分子蛋白或多肽，在植物防御病虫害为害中起到重要的作用。昆虫取食后，蛋白酶抑制剂可与昆虫的蛋白水解酶相结合，抑制昆虫对蛋白质的消化和吸收，另一方面会引起昆虫蛋白酶的过量合成和分泌，干扰昆虫的正常代谢。在烟草中目前只开展了胰蛋白酶抑制剂和糜蛋白酶抑制剂部分研究，证明蛋白酶抑制剂跟烟草的抗虫性密切相关[8-9]。
2 防御物质合成的相关基因
2.1 氧化酶
活性氧的快速产生是植物应对病虫害防卫反应的重要标志，在逆境胁迫下，植物体会通过氧化酶积累大量的活性氧、阴离子过氧化物等，将组织中的相关成分氧化成毒性物质[10]。烟草中的氧化酶同源基因Narboh D的表达跟烟草体内活性氧的含量成正比[11]。
2.2 过氧化物酶
在植物体内，过氧化物酶在H2O2的帮助下能催化单酚、二酚及芳香胺反应生成对生物具有高度毒性的醌，从而起到抗病虫害的效果，植物在受到外力损伤的时候也相应地提高过氧化物酶基因的表达水平[12]。对烟草不同抗虫品种的研究表明，抗虫性越高其过氧化物酶及其同工酶的表达量及活性也越高[13-14]。
2.3 细胞色素氧化酶P450
细胞色素氧化酶P450调节植物次生代谢合成中的许多反应，包括生物碱、脂肪酸的前体及苯基异丙酮和植物毒素等。植物遇到虫害时，受害组织及其邻近部位将提高P450的表达量和活性，改变代谢过程，从而合成更多的上述次生物质，使植物产生抗虫性。烟草研究中表明，抑制细胞色素氧化酶P450水解酶基因的表达可显著提高烟草对烟蚜的抗性[15]。
2.4 谷氨酸脱羧酶
γ-氨基丁酸（Gamma-aminobutyrate，GABA）是一种四碳非蛋白氨基酸，可通过GABA介导的氯离子通道阻止无脊椎动物的神经传递。受损植物可通过快速积累GABA，从而对害虫起到暂时的麻痹作用，达到抗虫的效果[16]。GABA由谷氨酸脱羧酶合成，虫害可迅速诱导烟草谷氨酸脱羧酶基因的表达上调，从而增加GABA的含量[17-18]。
3 茉莉酸信号途径
茉莉酸信号传导途径是指植物以茉莉酸（jasmonic acid，JA）和茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）介导的防御系统[19]。植物被昆虫为害后，通过茉莉酸信号途径诱导合成具有毒杀作用的植物次生代谢物质，茉莉酸本身不具有杀虫作用。茉莉酸信号途径是目前烟草中研究最为详细的植物防御系统，包括茉莉酸合成的上游调控基因、小分子物质以及主要合成酶等[20-25]。Wang等[19]以烟草为模式生物，详细叙述了茉莉酸生物合成途径。昆虫取食烟草时，其分泌物中的脂肪酸氨基酸合物（FACs）进入植物组织诱导植物激活水杨酸诱导蛋白激酶（SIPK）和损伤诱导蛋白激酶（WIPK），在这两种蛋白激酶的共同作用下激活茉莉酸的合成：叶绿体内首先在质体甘油脂酶A1（GLA1）的作用下生成α-亚麻酸，α-亚麻酸在脂氧合酶（LOX3）、丙二烯合成酶（AOS）和丙二烯氧化环化酶（AOC）的共同催化作用下生成稳定的中间体12-氧-二烯酸（OPDA），OPDA随后转变为过氧物酶体，在OPDA还原酶（OPR3）和三步氧化还原反映下转化为茉莉酸。植物茉莉酸合成受SIPK激酶、WIPK激酶、NPR1非表达因子、BAK1受体激酶、谷胱甘肽还原酶（GSNOR）和SKP1等位基因抑制子（SGT1）的正调控，受MPK4、CDPK4、CDPK5激酶和NOA1蛋白的负调控。茉莉酸进一步在茉莉酸抗性1（JAR）的作用下生成茉莉酸异亮氨酸，在茉莉酸羧基甲基转移酶（JMT）作用下生成茉莉酸甲酯、顺式茉莉酸和12-羟基茉莉酸。茉莉酸异亮氨酸结合泛素连接酶SCFCOI1起始茉莉酸途径负调控子的JAZ蛋白的降解。在无茉莉酸的条件下，JAZ蛋白可与茉莉酸信号途径的正向转录调控因子MYC2相互作用。在内外信号的作用下，茉莉酸异亮氨酸合成后特异性与COI1结合，促进COI1和JAZ蛋白的生理互作，导致JAZ蛋白在26S蛋白酶体的作用下降解，从而激活MYC2转录因子诱导尼古丁、蛋白酶抑制剂和17-羟基四烯醇二萜糖苷等防御化合物的产生。
4 问题与展望
发展环境友好型的害虫治理方法已成为现代植物保护研究的焦点，植物源抗虫基因的开发和利用无疑是达到此目的的重要手段之一。目前，烟草抗虫基因的研究相对落后，例如生物碱等重要的抗虫基因未见相关研究，但是烟草全基因组测序的完成为挖掘烟草抗虫基因奠定了坚实的基础。基于此，利用以下两种方法可快速地筛选烟草抗虫基因进行理论和应用研究：（1）根据其他作物中已报道的抗虫基因，筛选烟草同源基因，进行抗虫性研究；（2）通过研究害虫与烟草的互作关系，获得抗虫性材料，利用现代分子生物方法，例如芯片、RNA-seq技术等[26]，分析获得烟草抗虫基因，并进行后续的理论和应用研究。随着烟草抗虫基因的深入研究，必将产生病虫害防治的新方法用于烟草的安全生产。 参考文献
[1] Wu J， Baldwin I T. New insights into plant responses to the attack from insect herbivores[J]. Annu Rev Genet， 2010， 44： 1-24.
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insect and disease resistance and smoke quality[J]. Recent Adv Tobacco Sci， 1985， 11： 105-174.
[5] Thurston R， Webster J A. Toxicity of Nicotian agossei domin to Myzuspersicae （Sulzer） [J]. Entomol Exp Appl， 1962， 5： 233-238.
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[7] 高熹，潘贤丽. 烟草抗虫性研究进展[J]. 热带农业科学， 2004， 24（6）： 59-67.
[8] Anderson M A， Van Heeswijck R， West J， et al. Proteinase inhibitors from Nicotiana alata enhance plant resistance to insect pests[J]. J Insect Physiol， 1997， 43： 833-842.
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[11] Wu J， Wang L， Wunsche H， et al. Narboh D， a respiratory burst oxidase homolog in Nicotiana attenuata， is required for late defense responses after herbivore attack[J]. J Integr Plant Biol， 2013， 55： 187-198.
[12] Hiraga S， Ito H， Sasaki K， et al. Wound-induced expression of a tobacco peroxidase is not enhanced by ethephon and suppressed by methyl jasmonate and coronatine[J]. Plant Cell Physiology， 2000， 41： 165-170.
[13] Dowd P F， Holmes R A， Pinkerton T S， et al. Relative activity of a tobacco hybrid expressing high levels of a tobacco anionic peroxidase and maize ribosome-inactivating protein against Helicoverpa zea and Lasioderma serricorne[J]. J Agric Food Chem， 2006， 54： 2629-2634.
[14] Dowd P F， Lagrimini L M， Nelsen T C. Relative resistance of transgenic tomato tissues expressing high levels of tobacco anionic peroxidase to different insect species[J]. Nat Toxins， 1998， 6： 241-249. [15] Wang， E， Wang R， DeParasis J， et al. Suppression of a P450 hydroxylase gene in plant trichome glands enhances natural-product-based aphid resistance[J]. Nat Biotechnol， 2001， 19： 371-374.
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[17] Bown A W， Hall D E， MacGregor K B. Insect footsteps on leaves stimulate the accumulation of 4-aminobutyrate and can be visualized through increased chlorophyll fluorescence and superoxide production[J]. Plant Physiol， 2002， 129： 1430-1434.
[18] MacGregor K B， Shelp B J， Peiris S et al. Overexpression of glutamate decarboxylase in transgenic tobacco plants deters feeding by phytophagous insect larvae[J]. J Chem Ecol， 2003， 29： 2177-2182.
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[20] Gaquerel E， Steppuhn A， Baldwin I T. Nicotiana attenuata alpha-DIOXYGENASE1 through its production of 2-hydroxylinolenic acid is required for intact plant defense expression against attack from Manduca sexta larvae[J]. New Phytol， 2012， 196： 574-585.
[21] Hettenhausen C， Baldwin I T， Wu J. Nicotiana attenuata MPK4 suppresses a novel jasmonic acid （JA） signaling-independent defense pathway against the specialist insect Manduca sexta， but is not required for the resistance to the generalist Spodoptera littoralis[J]. New Phytol， 2013，199： 787-799.
[22] Woldemariam M G， Dinh S T， Oh Y， et al. NaMYC2 transcription factor regulates a subset of plant defense responses in Nicotiana attenuata[J]. BMC Plant Biol， 2013， 13： 73.
[23] Wunsche H， Baldwin I T， Wu J. S-Nitrosoglutathione reductase （GSNOR） mediates the biosynthesis of jasmonic acid and ethylene induced by feeding of the insect herbivore Manduca sexta and is important for jasmonate-elicited responses in Nicotiana attenuata[J]. J Exp Bot， 2011， 62： 4605-4616.
[24] Yang D H， Hettenhausen C， Baldwin I T， et al. Silencing Nicotiana attenuata calcium-dependent protein kinases， CDPK4 and CDPK5， strongly up-regulates wound- and herbivory-induced jasmonic acid accumulations[J]. Plant Physiol， 2012， 159： 1591-1607.
[25] Ziegler J， Keinanen M， Baldwin I T. Herbivore-induced allene oxide synthase transcripts and jasmonic acid in Nicotiana attenuata[J]. Phytochemistry， 2001， 58： 729-738.
[26] Wu Y J， Wu Y J， Luo X， et al. Identification of differentially expressed genes that potentially confer pest resistance in transgenic ChIFN-gamma tobacco[J]. Gene， 2014， 543： 181-189.
1 蛋白酶抑制剂基因
植物蛋白酶抑制剂（proteinase inhibitor， PI）是一类能抑制蛋白酶活性的小分子蛋白或多肽，在植物防御病虫害为害中起到重要的作用。昆虫取食后，蛋白酶抑制剂可与昆虫的蛋白水解酶相结合，抑制昆虫对蛋白质的消化和吸收，另一方面会引起昆虫蛋白酶的过量合成和分泌，干扰昆虫的正常代谢。在烟草中目前只开展了胰蛋白酶抑制剂和糜蛋白酶抑制剂部分研究，证明蛋白酶抑制剂跟烟草的抗虫性密切相关[8-9]。
2 防御物质合成的相关基因
2.1 氧化酶
活性氧的快速产生是植物应对病虫害防卫反应的重要标志，在逆境胁迫下，植物体会通过氧化酶积累大量的活性氧、阴离子过氧化物等，将组织中的相关成分氧化成毒性物质[10]。烟草中的氧化酶同源基因Narboh D的表达跟烟草体内活性氧的含量成正比[11]。
2.2 过氧化物酶
在植物体内，过氧化物酶在H2O2的帮助下能催化单酚、二酚及芳香胺反应生成对生物具有高度毒性的醌，从而起到抗病虫害的效果，植物在受到外力损伤的时候也相应地提高过氧化物酶基因的表达水平[12]。对烟草不同抗虫品种的研究表明，抗虫性越高其过氧化物酶及其同工酶的表达量及活性也越高[13-14]。
2.3 细胞色素氧化酶P450
细胞色素氧化酶P450调节植物次生代谢合成中的许多反应，包括生物碱、脂肪酸的前体及苯基异丙酮和植物毒素等。植物遇到虫害时，受害组织及其邻近部位将提高P450的表达量和活性，改变代谢过程，从而合成更多的上述次生物质，使植物产生抗虫性。烟草研究中表明，抑制细胞色素氧化酶P450水解酶基因的表达可显著提高烟草对烟蚜的抗性[15]。
2.4 谷氨酸脱羧酶
γ-氨基丁酸（Gamma-aminobutyrate，GABA）是一种四碳非蛋白氨基酸，可通过GABA介导的氯离子通道阻止无脊椎动物的神经传递。受损植物可通过快速积累GABA，从而对害虫起到暂时的麻痹作用，达到抗虫的效果[16]。GABA由谷氨酸脱羧酶合成，虫害可迅速诱导烟草谷氨酸脱羧酶基因的表达上调，从而增加GABA的含量[17-18]。
3 茉莉酸信号途径
茉莉酸信号传导途径是指植物以茉莉酸（jasmonic acid，JA）和茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）介导的防御系统[19]。植物被昆虫为害后，通过茉莉酸信号途径诱导合成具有毒杀作用的植物次生代谢物质，茉莉酸本身不具有杀虫作用。茉莉酸信号途径是目前烟草中研究最为详细的植物防御系统，包括茉莉酸合成的上游调控基因、小分子物质以及主要合成酶等[20-25]。Wang等[19]以烟草为模式生物，详细叙述了茉莉酸生物合成途径。昆虫取食烟草时，其分泌物中的脂肪酸氨基酸合物（FACs）进入植物组织诱导植物激活水杨酸诱导蛋白激酶（SIPK）和损伤诱导蛋白激酶（WIPK），在这两种蛋白激酶的共同作用下激活茉莉酸的合成：叶绿体内首先在质体甘油脂酶A1（GLA1）的作用下生成α-亚麻酸，α-亚麻酸在脂氧合酶（LOX3）、丙二烯合成酶（AOS）和丙二烯氧化环化酶（AOC）的共同催化作用下生成稳定的中间体12-氧-二烯酸（OPDA），OPDA随后转变为过氧物酶体，在OPDA还原酶（OPR3）和三步氧化还原反映下转化为茉莉酸。植物茉莉酸合成受SIPK激酶、WIPK激酶、NPR1非表达因子、BAK1受体激酶、谷胱甘肽还原酶（GSNOR）和SKP1等位基因抑制子（SGT1）的正调控，受MPK4、CDPK4、CDPK5激酶和NOA1蛋白的负调控。茉莉酸进一步在茉莉酸抗性1（JAR）的作用下生成茉莉酸异亮氨酸，在茉莉酸羧基甲基转移酶（JMT）作用下生成茉莉酸甲酯、顺式茉莉酸和12-羟基茉莉酸。茉莉酸异亮氨酸结合泛素连接酶SCFCOI1起始茉莉酸途径负调控子的JAZ蛋白的降解。在无茉莉酸的条件下，JAZ蛋白可与茉莉酸信号途径的正向转录调控因子MYC2相互作用。在内外信号的作用下，茉莉酸异亮氨酸合成后特异性与COI1结合，促进COI1和JAZ蛋白的生理互作，导致JAZ蛋白在26S蛋白酶体的作用下降解，从而激活MYC2转录因子诱导尼古丁、蛋白酶抑制剂和17-羟基四烯醇二萜糖苷等防御化合物的产生。
4 问题与展望
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insect and disease resistance and smoke quality[J]. Recent Adv Tobacco Sci， 1985， 11： 105-174.
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