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摘 要：水稻叶穗色泽突变体为解析不同器官叶绿素生物合成之间的内在联系提供了优良的遗传材料。本研究鉴定了1份白叶白穗突变体wlwp7（white leaf and white panicle 7），分析了wlwp7的形態、生理和遗传特点。结果表明：wlwp7对低温敏感，当环境温度为20 ℃时苗期叶片白化，但温度升高至30 ℃后叶色正常;大田环境下wlwp7抽穗后颖壳白化，叶绿素含量降低至野生型的40.73%;除结实率较野生型T98B下降6.28%外，其他产量性状不受影响;遗传分析发现，wlwp7与T98B的正反杂交F2群体中都未出现白叶绿穗和绿叶白穗重组单株，经卡方检测白叶白穗突变单株与绿叶绿穗野生型单株的理论分离比符合1∶ 表明白叶白穗性状受同一隐性核基因控制;利用BSA策略进一步将wlwp7定位在第3染色体上一个280 kb的区域内，该区域未有已报道的白叶白穗基因。本研究发现了wlwp7同时控制叶部和穗部叶绿素合成，精细定位结果为最终克隆wlwp7奠定了基础。
关键词：水稻;白叶白穗突变体;叶绿素;基因定位
中图分类号：S511 文献标识码：A
Identification and Gene Mapping of a White Leaf and White Panicle Mutant wlwp7 in Rice
LI Zheli1，3， ZHANG Linjin1，3， TAN Ying2，3， WU Zhaohui3，4， XIAO Feng1， SU Yuting1， TAN Yanning3，4*， XIAO Yinghui
1. College of Agriculture， Hunan Agricultural University， Changsha， Hunan 410128， China; 2. College of Biological Science and Technology， Hunan Agricultural University， Changsha， Hunan 410128， China; 3. State Key Laboratory of Hybrid Rice， Hunan Hybrid Rice Research Center， Changsha， Hunan 410125， China; 4. Long Ping Branch， Graduate School of Hunan University， Changsha， Hunan 410125， China
Abstract： Rice mutants varied both in leaf color and panicle color are valuable genetic resources for revealing the link of chlorophyll biosynthesis between different organs. Here， a white leaf and white panicle 7 mutant （wlwp7） was identified and analyzed from morphological， physiological and genetic levels. It showed that the seedling plants of wlwp7 was sensitive to low temperature with white leaves at 20 ℃. While， it became green at a high temperature of 30 ℃. The paddy plants of wlwp7 was observed to present white hulls at heading. The chlorophyll content in the hulls of wlwp7 was reduced to 40.73% of its wild type T98B. Except for the seed-setting rate （with a decrease of 6.28%）， other yield traits remained unaffected. Further genetic analysis confirmed there was no recombinant plant with a phenotype of white leaf/green panicle or green leaf/white panicle in two F2 groups derived from wlwp7/T98B and T98B/wlwp7. Moreover， it found the theoretical segregation ratio of mutant plants to wild-type plants was consistent with 1：3 by chi square test， supporting wlwp7 would be controlled via one recessive nuclear gene. Finally， wlwp7 was mapped within 280Kb on chromosome 3 using BSA strategy， and there is no reported gene controlling white leaf and white panicle in this area. This study reveals that wlwp7 functions in regulating the chlorophyll bio-synthesis in leaves and panicles， and the gene mapping results provides a basis for the cloning of wlwp7. Keywords： rice; white leaf and white panicle mutant; chlorophyll; gene mapping
DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.09.010
叶绿素广泛分布于绿色植物的光合器官中，起吸收、传递和转化光能的作用，对植物生长发育和农作物产量形成具有重要意义[1]。叶是高等植物光合作用的主要器官，叶肉细胞通过制造大量的有机物来满足不同阶段生长发育和形态建成的需要[2]。穗也是重要的光合器官，谷类作物的穗器官（主要是颖壳和枝梗）能积累叶绿素，具有制造碳水化合物的能力[3];在水分亏损导致叶光合能力降低的条件下，穗器官能储存和动员光合产物促进籽粒灌浆[4-5]。光合作用对水稻干物质生产的贡献率达到了90%，稳定叶穗中的叶绿素含量已成为塑造和培育高光效高产群体的重要手段;目前，以叶、穗等器官的色泽突变体为主要对象，运用分子生物技术已克隆了参与水稻叶绿素生物合成[6]、降解[7]及调控[8]等相关的功能基因，为定向调控叶绿素含量及指导高光效高产育种奠定了基础[9]。
白化是一种常见的叶绿体发育缺陷和叶绿素亏损型变异现象，可单独或同时表现于叶、穗等部位;该类型材料能完成前质体至白色体的分化，但白色体不能发育至黄化质体或成熟叶绿体，其生理成因是白色體片层结构中积累原脱植基叶绿素，而原脱植基叶绿素不能还原成脱植基叶绿素[10]。目前，关于控制水稻叶片和穗器官白化的分子机理已取得了重大进展[11-12]，但值得思考的一个问题是，既然叶绿素合成途径和调控网络高度保守，为什么某些基因即使是组成型表达基因（如OsPPR6[13]）的突变只造成特定器官的失绿而不会波及所有光合器官呢？这启示我们不同光合器官既遵循叶绿素合成的共同机制又选择性地保留了适合自身需求的调节机制，而鉴定叶穗色泽突变体将为解析不同器官叶绿素生物合成之间的内在联系提供优良的遗传材料。
本课题组从T98B的辐射诱变后代中发现了1份白叶白穗突变体wlwp7，但是wlwp7的生理和遗传行为尚不清楚;为此，本研究拟从多个角度分析wlwp7的特征特性并精细定位wlwp7，研究结果将为wlwp7克隆及功能分析奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
水稻‘T98B’是我国长江流域常用的籼稻保持系;wlwp7是利用60Co-γ射线诱变‘T98B’后获得的低温敏感型白叶白穗突变体，已自交稳定至M8代。
1.2 方法
1.2.1 wlwp7的表型及叶绿素素含量分析 将‘T98B’和wlwp7的成熟种子37 ℃浸种催芽1 d，置于20、25、30 ℃等3个温度的恒温光照培养箱中催芽生长至3叶期，持续观察叶色变化，取第2片叶测定色素含量;另一方面，夏季在湖南杂交水稻研究中心长沙县春华镇大田种植‘T98B’和wlwp7，于6月中旬观察穗部色泽情况，并取‘T98B’和wlwp7抽穗第1天颖壳测定色素含量。将色素测定部位剪成长宽2～3 mm的小片，称取0.1～0.2 g，于无水乙醇中4 ℃避光浸提48 h，用分光光度计测量665、649、470 nm的OD值并计算叶绿素含量测定叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量[6]。
1.2.2 wlwp7的遗传分析 将‘T98B’和wlwp7正反交后获得F1和F2种子。在20 ℃恒温光照培养箱中对F2种子进行发芽培养，待生长14 d后统计各群体中的白叶表型和绿叶表型植株数;然后，上调温度至28 ℃培养1周，再转至大田高温条件下生长（生育期内平均气温23～34 ℃），统计白叶白穗、白叶绿穗、绿叶白穗和绿叶绿穗4种类型单株的数量和分离比，经卡方检测推断白叶与白穗性状的连锁关系。
1.2.3 wlwp7的基因定位 利用wlwp7与正常穗色粳稻品种‘日本晴’的杂交F2群体定位白叶白穗基因。参照BSA方法[14]，随机挑选25个白穗单株和25个绿穗单株按CTAB法[15]提取叶片DNA，构建隐性池和显性池，再选择均匀分布于12条染色体的112对SSR或InDel标记进行连锁分析，将白穗基因定位至某一染色体上。进一步开发InDel标记，利用497个隐性单株鉴定紧密连锁标记，精细定位wlwp7;在水稻基因组注释系统RGAP（http：//rice.plantbiology.msu.edu/index. shtml）中根据注释信息分析定位区域内是否含有已知的白叶白穗基因。wlwp7基因定位主要引物信息见表1。
1.2.4 wlwp7的农艺状考察 2020年6月，将‘T98B’和wlwp7种植于湖南杂交水稻研究中心长沙县春华镇试验基地，每份材料种植100穴，每穴2苗;于成熟期，取达到平均分蘖水平的5穴稻株考察株高、穗长、结实率和千粒重等指标。
1.3 数据分析
使用SPSS 12.1软件分析突变体和野生型各指标在0.05和0.01水平有无显著性差异。
2 结果与分析
2.1 wlwp7的表型观察
2017—2019年连续观察发现，wlwp7在长沙早春季节播种时（如3月下旬，平均气温10.0～16.5 ℃）叶片白化，而在夏季播种时（如6月上旬，平均气温24.0～26.5 ℃）叶色正常。为了明确wlwp7的低温敏感特性，在3个人工处理温度条件下观察wlwp7的苗期叶色表型;结果表明，在20 ℃的低温条件下，wlwp7的叶片大面积白化（仅叶尖部分呈浅绿色）;在25 ℃的适温条件下，其第1片叶呈绿色而新出叶叶缘仍发生白化;当温度升高至30 ℃时，叶片全绿，而野生型‘T98B’在3种温度条件下皆为绿叶表型（图1A）。 于2019年4月下旬（此后日均温度超过21 ℃，抽穗期日均温超过26 ℃）移栽wlwp7后，可见其株型结构、叶色与野生型无明显差异，但穗部色泽有显著变化（图1B）;抽穗后wlwp7的第1、3、5天颖壳和穗枝梗白化（图1C～D），成熟后谷粒呈灰白色，而对照为谷黄色（图1E）。
2.2 wlwp7的色素含量分析
取上述3种温度处理下的苗期叶片测定叶绿素含量，结果显示在20 ℃的低温条件下wlwp7的叶绿素含量几乎为0;在25 ℃的适温下，叶绿素a（Chla）、叶绿素b（Chlb）和总叶绿素含量分别为野生型T98B的41.71%、44.37%和42.42%，差异均为极显著（P<0.01），在30 ℃的高温下叶绿素含量明显升高并达到了野生型水平（图2A）。取大田生长植株测定颖壳叶绿素含量，发现wlwp7抽穗后第1天的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量均与野生型具有极显著差异，分别为野生型T98B的40.82%、40.48%和40.73%（图2B）。
2.3 wlwp7的遗传分析
由表2可知，T98B和wlwp7的正交和反交F1都表现为与野生型一致的绿叶绿穗表型，说明白叶白穗性状受隐性核基因控制;2个F2群体都出现了正常的绿叶绿穗单株和白叶白穗单株，且未见有白叶绿穗和绿叶白穗的重组类型单株，经χ2检测白叶白穗单株和绿叶绿穗单株的理论分离比为1∶ 表明白叶白穗表型只受1对隐性核基因控制。
2.4 wlwp7的基因定位
利用在wlwp7与‘日本晴’中表现为多态性的77个SSR或InDel标记分析了F2隐性混池和显性混池DNA之间的基因型差异，发现第3染色体多个SSR标记如CHR305、ZM3-27与目的基因存在连锁关系，表明wlwp7位于第3染色体上（图3）。然后，利用497个白穗单株并发展多态性标记缩小定位区间，最终将wlwp7精细定位至Ind8和Ind8-3之间。定位区域对应‘日本晴’基因组的物理位置范围为25 493 396～25 775 501 bp，共含有35个基因;经查搜RGAP数据库，该区域内没有已知的的白叶白穗基因，但存在2个叶色基因，其中1个为编码叶绿素b还原酶的NOL 基因（LOC_Os03g45194），另一个编码含NusB结构域的质体蛋白基因V1（LOC_Os03g45400）。
2.5 wlwp7的农艺性状分析
wlwp7的植株形态与‘T98B’相似，株型松散適中，叶上禾，剑叶较长，分蘖力中等，着粒较稀疏，粒细长;在具体产量性状方面，除结实率下降了6.28%外，wlwp7与‘T98B’的生育期、株高、穗长、有效穗数、每穗粒数、粒长、粒宽和千粒重等指标的差异不显著（表3），表明wlwp7的产量结构基本不受影响。
3 讨论
叶和颖壳都含有叶绿素，二者叶绿素合成的紊乱都有可能导致白化。从数量上来看，白叶突变体最多，白叶白穗突变体和白穗突变体相对较少[16]。在已鉴定的白穗突变体中，除wp（t）、wp6和wp7仅局限于穗部变异外[17-19]，其他大多数突变体的白化性状同时在叶片中得到了表达;在这些突变体中，白化表型对温度的敏感性可能不太一致，如wp1和wp2对温度不敏感[20-21]，wlp6、slwp和st_wp的叶片对低温敏感且wlp6升高温度穗部转绿[22-24]，而wlp2的叶片和颖壳都对高温敏感（34 ℃的高温条件下白化）。另一方面，白化发生时期也有所不同，如wslwp在芽期就出现白化，其第1叶全白但后续新叶的叶尖沿叶脉渐渐转绿[25]，而wsp1在发育至3叶期或4叶期才发生白化[26]。本研究所鉴定的白叶白穗突变体wlwp7在苗期对低温（20 ℃）敏感，增加温度能恢复至绿叶表型;wlwp7抽穗早期穗部内外稃及二次枝梗也发生明显白化，但白穗表型对温度是否敏感尚不清楚。此外，我们还注意到wlwp7与‘日本晴’的F2后代中的白穗个体的穗部白化程度不尽一致，这一现象与st_wp类似，暗示遗传背景可能干扰白穗性状的表达。
在已定位或克隆的白穗（含白叶白穗）基因中，除st_fon受细胞质基因控制外，其余基因均为细胞核基因，且呈隐性遗传[27]。研究进一步发现，大部分白穗基因的蛋白产物是核酸工具酶或核糖体的基本组成成分。如WP1编码1个Val-tRNA合成酶OsVALRS2[20]，WLP1编码1个50S核糖体L13蛋白[28]，他们都影响叶绿体中核糖体的组装;WSP1编码1个细胞器RNA编辑因子（MORF）家族蛋白，突变后影响质体核糖核酸的编辑（ndhA剪接受到损伤）[26];WLP2与Os TrxZ、Os FLN2组成质体转录激活复合体（TAC）亚基共同调节PEP聚合酶的活性[12]。WLWP7被定位在第3号染色体，定位区域内包含了白化转绿基因V1和滞绿叶基因NOL[29-30]，但未发现有已报道的白叶白穗基因;考虑到V1参与质体蛋白的合成且其突变表型（叶片白化、对低温敏感[17]）与wlwp7类似，结合不同等位变异可导致表型差异现象（如ST1的2种等位变异出现白穗和绿穗2种表型），尚不能排除WLWP7与V1等位的可能。另一方面，白化性状既有可能局限于某一特定器官，也有可能发生在多个器官或全部营养器官（如st_fon），其丰富的表型与目的基因的特异性表达或组成型表达有关;WLWP7基因的克隆将为解析多器官叶绿素生物合成之间的内在联系提供线索，也将对认识条件型转绿的分子机制具有启发意义。
从农艺性状来看wlwp7的白化性状对植株生长势和穗粒结构影响不大;叶色标记是水稻育种中可利用的种质资源，wlwp7携带明显的穗色标记，可以将其转入水稻不育系中提高亲本和杂种的除杂效率[31]。后续工作将加强wlwp7的克隆和功能研究，同时探讨wlwp7在水稻育种中的利用价值。 wlwp7具有葉穗白化特点，在苗期对低温敏感，抽穗后颖壳和枝梗失绿，叶穗合成叶绿素能力显著降低;wlwp7的白叶和白穗性状受同一隐性核基因控制，推测其候选基因可能为编码NUS1的V1;白叶白穗突变体wlwp7的鉴定将为解析多器官叶绿素生物合成之间的内在联系提供新材料。
参考文献
[1] Von Wettstein D， Gough S， Kannangara C G. Chlorophyll biosynthesis[J]. Plant Cell， 1995： 1039-1057.
[2] Adachi S， Nakae T， Uchida M， et al. The mesophyll anatomy enhancing CO2 diffusion is a key trait for improving rice photosynthesis[J]. Journal of Experimental Botany， 2013， 64（4）： 1061-1072.
[3] Araus J L， Brown H R， Febrero A， et al. Ear photosynthesis， carbon isotope discrimination and the contribution of respiratory CO2 to differences in grain mass in durum wheat[J]. Plant， Cell and Environment， 1993， 16（4）： 383-392.
[4] Tambussi E A， Bort J， Guiamet J J， et al. The photosynthetic role of ears in C3 cereals： metabolism， water use efficiency and contribution to grain yield[J]. Critical Reviews in Plant Sciences， 2007， 1（26）： 1-16.
[5] Maydup M L， Antonietta M， Guiamet J J， et al. The contribution of ear photosynthesis to grain filling in bread wheat （Triticum aestivum L.）[J]. Field Crops Research， 2010， 119（1）： 48-58.
[6] Wu Z， Zhang X， He B， et al. A chlorophyll-deficient rice mutant with impaired chlorophyllide esterification in chlorophyll biosynthesis[J]. Plant Physiology， 2007， 145（1）： 29-40.
[7] Sato Y， Morita R， Katsuma S， et al. Two short-chain dehydrogenase/reductases， NON-YELLOW COLORING 1 and NYC1-LIKE， are required for chlorophyll b and light- harvesting complex II degradation during senescence in rice[J]. Plant Journal， 2009， 57（1）： 120-131.
[8] He Y， Shi Y F， Zhang X B， et al. The OsABCI7 transporter interacts with OsHCF222 to stabilize the thylakoid membrane in rice[J]. Plant Physiology， 2020， 184（1）： 283-299.
[9] Shin D， Lee S， Kim T H， et al. Natural variations at the Stay-Green gene promoter control lifespan and yield in rice cultivars[J]. Nature Communications， 2020， 11（1）： 1-11.
[10] Sakuraba Y， Rahman M L， Cho S H， et al. The ricefaded green leaflocus encodes protochlorophyllide oxidoreductase B and is essential for chlorophyll synthesis under high light conditions[J]. Plant Journal， 2013， 74（1）： 122-133.
[11] Liu C， Zhu H， Xing Y， et al. Albino Leaf 2 is involved in the splicing of chloroplast group I and II introns in rice[J]. Journal of Experimental Botany， 2016， 67（18）： 5339-5347. [12] Lv Y， Shao G， Qiu J， et al. White Leaf and Panicle 2， encoding a PEP-associated protein， is required for chloroplast biogenesis under heat stress in rice[J]. Journal of Experimental Botany， 2017， 68（18）： 5147-5160.
[13] Tang J P， Zhang W W， Wen K， et al. OsPPR6， a pentatricopeptide repeat protein involved in editing and splicing chloroplast RNA， is required for chloroplast biogenesis in rice[J]. Plant Molecular Biology， 2017， 95（4/5）： 345-357.
[14] Michelmore R W， Paran I， Kesseli R V. Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis： a rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 1991， 88（21）： 9828-9832.
[15] Rogers S O， Bendich A J. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh， herbarium and mummified plant tissues[J]. Plant Molecular Biology， 1985， 5（2）： 69-76.
[16] 全瑞兰， 王青林， 马汉云， 等. 水稻白化转绿突变体研究进展[J]. 安徽农学通报， 2015， 21（12）： 17-20， 95.
[17] 李红昌， 钱 前， 王 赟， 等. 水稻白穗突变体基因的鉴定和染色体定位[J]. 科学通报， 2003， 48（3）： 268-270.
[18] 从夕汉， 阮新民， 罗志祥， 等. 水稻白穗突变体wp6的发现及研究[J]. 安徽农业科学， 2018， 46（36）： 29-31.
[19] 陈 云， 梁艳玲， 杜双林， 等. 水稻白穗突变体wp7的鉴定及基因定位[J]. 分子植物育种， 2021， 19（12）： 4032-4039.
[20] Wang Y L， Wang C M， Zheng M， et al. WHITE PANICLE1， a val-tRNA synthetase regulating chloroplast ribosome biogenesis in rice， is essential for early chloroplast development[J]. Plant Physiology， 2016， 170（4）： 2110-2123.
[21] Sanchez A C， Khush G S. Chromosomal location of some marker genes in rice using the primary trisomics[J]. The Journal of Heredity， 1994， 85（4）： 297-300.
[22] 李玲鋒， 熊玉毅， 欧阳林娟， 等. 水稻白条纹叶及白穗突变体wlp6的鉴定与基因定位[J]. 中国水稻科学， 2018， 32（6）： 538-548.
[23] 周坤能， 夏加发， 马廷臣， 等. 水稻条纹叶和白穗基因SLWP的定位及变异分析[J]. 中国水稻科学， 2018， 32（4）： 325-334.
[24] 陈叶平， 翟 哲， 杨文君， 等. 水稻条白叶和白穗突变基因St-wp的遗传分析与精细定位[J]. 核农学报， 2015， 29（7）： 1246-1252.
[25] 金 怡， 刘合芹， 汪得凯， 等. 一个水稻苗期白条纹叶及抽穗期白穗突变体的鉴定和基因定位[J]. 中国水稻科学， 2011， 25（5）： 461-466. [26] Zhang Z G， Cui X A， Wang Y W， et al. The RNA editing factor WSP1 is essential for chloroplast development in rice[J]. Molecular Plant， 2017， 10（1）： 86-98.
[27] 陈德西， 李 婷， 曲广林， 等. 水稻条斑和颖花异常突变体st-fon的鉴定与遗传分析[J]. 中国水稻科学， 2012， 26（6）： 677-685.
[28] Song J， Wei X J， Shao G N， et al. The rice nuclear gene WLP1 encoding a chloroplast ribosome L13 protein is needed for chloroplast development in rice grown under low temperature conditions[J]. Plant Molecular Biology， 2014， 84（3）： 301-314.
[29] Iba K， Takamiya K I， Toh Y， et al. Formation of functionally active chloroplasts is determined at a limited stage of leaf development in virescent mutants of rice[J]. Developmental Genetics， 1991， 12（5）： 342-348.
[30] Kusumi K， Sakata C， Nakamura T， et al. A plastid protein NUS1 is essential for build-up of the genetic system for early chloroplast development under cold stress conditions[J]. The Plant Journal， 2011， 68（6）： 1039-1050.
[31] Wu D X， Shen S Q， Cui H R， et al. A novel thermo/photoperiod-sensitive genic male-sterile （T/PGMS） rice mutant with green-revertible albino leaf color marker induced by gamma irradiation[J]. Field Crops Research， 2003， 81（2/3）： 141-147.
責任编辑：黄东杰
关键词：水稻;白叶白穗突变体;叶绿素;基因定位
中图分类号：S511 文献标识码：A
Identification and Gene Mapping of a White Leaf and White Panicle Mutant wlwp7 in Rice
LI Zheli1，3， ZHANG Linjin1，3， TAN Ying2，3， WU Zhaohui3，4， XIAO Feng1， SU Yuting1， TAN Yanning3，4*， XIAO Yinghui
1. College of Agriculture， Hunan Agricultural University， Changsha， Hunan 410128， China; 2. College of Biological Science and Technology， Hunan Agricultural University， Changsha， Hunan 410128， China; 3. State Key Laboratory of Hybrid Rice， Hunan Hybrid Rice Research Center， Changsha， Hunan 410125， China; 4. Long Ping Branch， Graduate School of Hunan University， Changsha， Hunan 410125， China
Abstract： Rice mutants varied both in leaf color and panicle color are valuable genetic resources for revealing the link of chlorophyll biosynthesis between different organs. Here， a white leaf and white panicle 7 mutant （wlwp7） was identified and analyzed from morphological， physiological and genetic levels. It showed that the seedling plants of wlwp7 was sensitive to low temperature with white leaves at 20 ℃. While， it became green at a high temperature of 30 ℃. The paddy plants of wlwp7 was observed to present white hulls at heading. The chlorophyll content in the hulls of wlwp7 was reduced to 40.73% of its wild type T98B. Except for the seed-setting rate （with a decrease of 6.28%）， other yield traits remained unaffected. Further genetic analysis confirmed there was no recombinant plant with a phenotype of white leaf/green panicle or green leaf/white panicle in two F2 groups derived from wlwp7/T98B and T98B/wlwp7. Moreover， it found the theoretical segregation ratio of mutant plants to wild-type plants was consistent with 1：3 by chi square test， supporting wlwp7 would be controlled via one recessive nuclear gene. Finally， wlwp7 was mapped within 280Kb on chromosome 3 using BSA strategy， and there is no reported gene controlling white leaf and white panicle in this area. This study reveals that wlwp7 functions in regulating the chlorophyll bio-synthesis in leaves and panicles， and the gene mapping results provides a basis for the cloning of wlwp7. Keywords： rice; white leaf and white panicle mutant; chlorophyll; gene mapping
DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.09.010
叶绿素广泛分布于绿色植物的光合器官中，起吸收、传递和转化光能的作用，对植物生长发育和农作物产量形成具有重要意义[1]。叶是高等植物光合作用的主要器官，叶肉细胞通过制造大量的有机物来满足不同阶段生长发育和形态建成的需要[2]。穗也是重要的光合器官，谷类作物的穗器官（主要是颖壳和枝梗）能积累叶绿素，具有制造碳水化合物的能力[3];在水分亏损导致叶光合能力降低的条件下，穗器官能储存和动员光合产物促进籽粒灌浆[4-5]。光合作用对水稻干物质生产的贡献率达到了90%，稳定叶穗中的叶绿素含量已成为塑造和培育高光效高产群体的重要手段;目前，以叶、穗等器官的色泽突变体为主要对象，运用分子生物技术已克隆了参与水稻叶绿素生物合成[6]、降解[7]及调控[8]等相关的功能基因，为定向调控叶绿素含量及指导高光效高产育种奠定了基础[9]。
白化是一种常见的叶绿体发育缺陷和叶绿素亏损型变异现象，可单独或同时表现于叶、穗等部位;该类型材料能完成前质体至白色体的分化，但白色体不能发育至黄化质体或成熟叶绿体，其生理成因是白色體片层结构中积累原脱植基叶绿素，而原脱植基叶绿素不能还原成脱植基叶绿素[10]。目前，关于控制水稻叶片和穗器官白化的分子机理已取得了重大进展[11-12]，但值得思考的一个问题是，既然叶绿素合成途径和调控网络高度保守，为什么某些基因即使是组成型表达基因（如OsPPR6[13]）的突变只造成特定器官的失绿而不会波及所有光合器官呢？这启示我们不同光合器官既遵循叶绿素合成的共同机制又选择性地保留了适合自身需求的调节机制，而鉴定叶穗色泽突变体将为解析不同器官叶绿素生物合成之间的内在联系提供优良的遗传材料。
本课题组从T98B的辐射诱变后代中发现了1份白叶白穗突变体wlwp7，但是wlwp7的生理和遗传行为尚不清楚;为此，本研究拟从多个角度分析wlwp7的特征特性并精细定位wlwp7，研究结果将为wlwp7克隆及功能分析奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
水稻‘T98B’是我国长江流域常用的籼稻保持系;wlwp7是利用60Co-γ射线诱变‘T98B’后获得的低温敏感型白叶白穗突变体，已自交稳定至M8代。
1.2 方法
1.2.1 wlwp7的表型及叶绿素素含量分析 将‘T98B’和wlwp7的成熟种子37 ℃浸种催芽1 d，置于20、25、30 ℃等3个温度的恒温光照培养箱中催芽生长至3叶期，持续观察叶色变化，取第2片叶测定色素含量;另一方面，夏季在湖南杂交水稻研究中心长沙县春华镇大田种植‘T98B’和wlwp7，于6月中旬观察穗部色泽情况，并取‘T98B’和wlwp7抽穗第1天颖壳测定色素含量。将色素测定部位剪成长宽2～3 mm的小片，称取0.1～0.2 g，于无水乙醇中4 ℃避光浸提48 h，用分光光度计测量665、649、470 nm的OD值并计算叶绿素含量测定叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量[6]。
1.2.2 wlwp7的遗传分析 将‘T98B’和wlwp7正反交后获得F1和F2种子。在20 ℃恒温光照培养箱中对F2种子进行发芽培养，待生长14 d后统计各群体中的白叶表型和绿叶表型植株数;然后，上调温度至28 ℃培养1周，再转至大田高温条件下生长（生育期内平均气温23～34 ℃），统计白叶白穗、白叶绿穗、绿叶白穗和绿叶绿穗4种类型单株的数量和分离比，经卡方检测推断白叶与白穗性状的连锁关系。
1.2.3 wlwp7的基因定位 利用wlwp7与正常穗色粳稻品种‘日本晴’的杂交F2群体定位白叶白穗基因。参照BSA方法[14]，随机挑选25个白穗单株和25个绿穗单株按CTAB法[15]提取叶片DNA，构建隐性池和显性池，再选择均匀分布于12条染色体的112对SSR或InDel标记进行连锁分析，将白穗基因定位至某一染色体上。进一步开发InDel标记，利用497个隐性单株鉴定紧密连锁标记，精细定位wlwp7;在水稻基因组注释系统RGAP（http：//rice.plantbiology.msu.edu/index. shtml）中根据注释信息分析定位区域内是否含有已知的白叶白穗基因。wlwp7基因定位主要引物信息见表1。
1.2.4 wlwp7的农艺状考察 2020年6月，将‘T98B’和wlwp7种植于湖南杂交水稻研究中心长沙县春华镇试验基地，每份材料种植100穴，每穴2苗;于成熟期，取达到平均分蘖水平的5穴稻株考察株高、穗长、结实率和千粒重等指标。
1.3 数据分析
使用SPSS 12.1软件分析突变体和野生型各指标在0.05和0.01水平有无显著性差异。
2 结果与分析
2.1 wlwp7的表型观察
2017—2019年连续观察发现，wlwp7在长沙早春季节播种时（如3月下旬，平均气温10.0～16.5 ℃）叶片白化，而在夏季播种时（如6月上旬，平均气温24.0～26.5 ℃）叶色正常。为了明确wlwp7的低温敏感特性，在3个人工处理温度条件下观察wlwp7的苗期叶色表型;结果表明，在20 ℃的低温条件下，wlwp7的叶片大面积白化（仅叶尖部分呈浅绿色）;在25 ℃的适温条件下，其第1片叶呈绿色而新出叶叶缘仍发生白化;当温度升高至30 ℃时，叶片全绿，而野生型‘T98B’在3种温度条件下皆为绿叶表型（图1A）。 于2019年4月下旬（此后日均温度超过21 ℃，抽穗期日均温超过26 ℃）移栽wlwp7后，可见其株型结构、叶色与野生型无明显差异，但穗部色泽有显著变化（图1B）;抽穗后wlwp7的第1、3、5天颖壳和穗枝梗白化（图1C～D），成熟后谷粒呈灰白色，而对照为谷黄色（图1E）。
2.2 wlwp7的色素含量分析
取上述3种温度处理下的苗期叶片测定叶绿素含量，结果显示在20 ℃的低温条件下wlwp7的叶绿素含量几乎为0;在25 ℃的适温下，叶绿素a（Chla）、叶绿素b（Chlb）和总叶绿素含量分别为野生型T98B的41.71%、44.37%和42.42%，差异均为极显著（P<0.01），在30 ℃的高温下叶绿素含量明显升高并达到了野生型水平（图2A）。取大田生长植株测定颖壳叶绿素含量，发现wlwp7抽穗后第1天的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量均与野生型具有极显著差异，分别为野生型T98B的40.82%、40.48%和40.73%（图2B）。
2.3 wlwp7的遗传分析
由表2可知，T98B和wlwp7的正交和反交F1都表现为与野生型一致的绿叶绿穗表型，说明白叶白穗性状受隐性核基因控制;2个F2群体都出现了正常的绿叶绿穗单株和白叶白穗单株，且未见有白叶绿穗和绿叶白穗的重组类型单株，经χ2检测白叶白穗单株和绿叶绿穗单株的理论分离比为1∶ 表明白叶白穗表型只受1对隐性核基因控制。
2.4 wlwp7的基因定位
利用在wlwp7与‘日本晴’中表现为多态性的77个SSR或InDel标记分析了F2隐性混池和显性混池DNA之间的基因型差异，发现第3染色体多个SSR标记如CHR305、ZM3-27与目的基因存在连锁关系，表明wlwp7位于第3染色体上（图3）。然后，利用497个白穗单株并发展多态性标记缩小定位区间，最终将wlwp7精细定位至Ind8和Ind8-3之间。定位区域对应‘日本晴’基因组的物理位置范围为25 493 396～25 775 501 bp，共含有35个基因;经查搜RGAP数据库，该区域内没有已知的的白叶白穗基因，但存在2个叶色基因，其中1个为编码叶绿素b还原酶的NOL 基因（LOC_Os03g45194），另一个编码含NusB结构域的质体蛋白基因V1（LOC_Os03g45400）。
2.5 wlwp7的农艺性状分析
wlwp7的植株形态与‘T98B’相似，株型松散適中，叶上禾，剑叶较长，分蘖力中等，着粒较稀疏，粒细长;在具体产量性状方面，除结实率下降了6.28%外，wlwp7与‘T98B’的生育期、株高、穗长、有效穗数、每穗粒数、粒长、粒宽和千粒重等指标的差异不显著（表3），表明wlwp7的产量结构基本不受影响。
3 讨论
叶和颖壳都含有叶绿素，二者叶绿素合成的紊乱都有可能导致白化。从数量上来看，白叶突变体最多，白叶白穗突变体和白穗突变体相对较少[16]。在已鉴定的白穗突变体中，除wp（t）、wp6和wp7仅局限于穗部变异外[17-19]，其他大多数突变体的白化性状同时在叶片中得到了表达;在这些突变体中，白化表型对温度的敏感性可能不太一致，如wp1和wp2对温度不敏感[20-21]，wlp6、slwp和st_wp的叶片对低温敏感且wlp6升高温度穗部转绿[22-24]，而wlp2的叶片和颖壳都对高温敏感（34 ℃的高温条件下白化）。另一方面，白化发生时期也有所不同，如wslwp在芽期就出现白化，其第1叶全白但后续新叶的叶尖沿叶脉渐渐转绿[25]，而wsp1在发育至3叶期或4叶期才发生白化[26]。本研究所鉴定的白叶白穗突变体wlwp7在苗期对低温（20 ℃）敏感，增加温度能恢复至绿叶表型;wlwp7抽穗早期穗部内外稃及二次枝梗也发生明显白化，但白穗表型对温度是否敏感尚不清楚。此外，我们还注意到wlwp7与‘日本晴’的F2后代中的白穗个体的穗部白化程度不尽一致，这一现象与st_wp类似，暗示遗传背景可能干扰白穗性状的表达。
在已定位或克隆的白穗（含白叶白穗）基因中，除st_fon受细胞质基因控制外，其余基因均为细胞核基因，且呈隐性遗传[27]。研究进一步发现，大部分白穗基因的蛋白产物是核酸工具酶或核糖体的基本组成成分。如WP1编码1个Val-tRNA合成酶OsVALRS2[20]，WLP1编码1个50S核糖体L13蛋白[28]，他们都影响叶绿体中核糖体的组装;WSP1编码1个细胞器RNA编辑因子（MORF）家族蛋白，突变后影响质体核糖核酸的编辑（ndhA剪接受到损伤）[26];WLP2与Os TrxZ、Os FLN2组成质体转录激活复合体（TAC）亚基共同调节PEP聚合酶的活性[12]。WLWP7被定位在第3号染色体，定位区域内包含了白化转绿基因V1和滞绿叶基因NOL[29-30]，但未发现有已报道的白叶白穗基因;考虑到V1参与质体蛋白的合成且其突变表型（叶片白化、对低温敏感[17]）与wlwp7类似，结合不同等位变异可导致表型差异现象（如ST1的2种等位变异出现白穗和绿穗2种表型），尚不能排除WLWP7与V1等位的可能。另一方面，白化性状既有可能局限于某一特定器官，也有可能发生在多个器官或全部营养器官（如st_fon），其丰富的表型与目的基因的特异性表达或组成型表达有关;WLWP7基因的克隆将为解析多器官叶绿素生物合成之间的内在联系提供线索，也将对认识条件型转绿的分子机制具有启发意义。
从农艺性状来看wlwp7的白化性状对植株生长势和穗粒结构影响不大;叶色标记是水稻育种中可利用的种质资源，wlwp7携带明显的穗色标记，可以将其转入水稻不育系中提高亲本和杂种的除杂效率[31]。后续工作将加强wlwp7的克隆和功能研究，同时探讨wlwp7在水稻育种中的利用价值。 wlwp7具有葉穗白化特点，在苗期对低温敏感，抽穗后颖壳和枝梗失绿，叶穗合成叶绿素能力显著降低;wlwp7的白叶和白穗性状受同一隐性核基因控制，推测其候选基因可能为编码NUS1的V1;白叶白穗突变体wlwp7的鉴定将为解析多器官叶绿素生物合成之间的内在联系提供新材料。
参考文献
[1] Von Wettstein D， Gough S， Kannangara C G. Chlorophyll biosynthesis[J]. Plant Cell， 1995： 1039-1057.
[2] Adachi S， Nakae T， Uchida M， et al. The mesophyll anatomy enhancing CO2 diffusion is a key trait for improving rice photosynthesis[J]. Journal of Experimental Botany， 2013， 64（4）： 1061-1072.
[3] Araus J L， Brown H R， Febrero A， et al. Ear photosynthesis， carbon isotope discrimination and the contribution of respiratory CO2 to differences in grain mass in durum wheat[J]. Plant， Cell and Environment， 1993， 16（4）： 383-392.
[4] Tambussi E A， Bort J， Guiamet J J， et al. The photosynthetic role of ears in C3 cereals： metabolism， water use efficiency and contribution to grain yield[J]. Critical Reviews in Plant Sciences， 2007， 1（26）： 1-16.
[5] Maydup M L， Antonietta M， Guiamet J J， et al. The contribution of ear photosynthesis to grain filling in bread wheat （Triticum aestivum L.）[J]. Field Crops Research， 2010， 119（1）： 48-58.
[6] Wu Z， Zhang X， He B， et al. A chlorophyll-deficient rice mutant with impaired chlorophyllide esterification in chlorophyll biosynthesis[J]. Plant Physiology， 2007， 145（1）： 29-40.
[7] Sato Y， Morita R， Katsuma S， et al. Two short-chain dehydrogenase/reductases， NON-YELLOW COLORING 1 and NYC1-LIKE， are required for chlorophyll b and light- harvesting complex II degradation during senescence in rice[J]. Plant Journal， 2009， 57（1）： 120-131.
[8] He Y， Shi Y F， Zhang X B， et al. The OsABCI7 transporter interacts with OsHCF222 to stabilize the thylakoid membrane in rice[J]. Plant Physiology， 2020， 184（1）： 283-299.
[9] Shin D， Lee S， Kim T H， et al. Natural variations at the Stay-Green gene promoter control lifespan and yield in rice cultivars[J]. Nature Communications， 2020， 11（1）： 1-11.
[10] Sakuraba Y， Rahman M L， Cho S H， et al. The ricefaded green leaflocus encodes protochlorophyllide oxidoreductase B and is essential for chlorophyll synthesis under high light conditions[J]. Plant Journal， 2013， 74（1）： 122-133.
[11] Liu C， Zhu H， Xing Y， et al. Albino Leaf 2 is involved in the splicing of chloroplast group I and II introns in rice[J]. Journal of Experimental Botany， 2016， 67（18）： 5339-5347. [12] Lv Y， Shao G， Qiu J， et al. White Leaf and Panicle 2， encoding a PEP-associated protein， is required for chloroplast biogenesis under heat stress in rice[J]. Journal of Experimental Botany， 2017， 68（18）： 5147-5160.
[13] Tang J P， Zhang W W， Wen K， et al. OsPPR6， a pentatricopeptide repeat protein involved in editing and splicing chloroplast RNA， is required for chloroplast biogenesis in rice[J]. Plant Molecular Biology， 2017， 95（4/5）： 345-357.
[14] Michelmore R W， Paran I， Kesseli R V. Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis： a rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 1991， 88（21）： 9828-9832.
[15] Rogers S O， Bendich A J. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh， herbarium and mummified plant tissues[J]. Plant Molecular Biology， 1985， 5（2）： 69-76.
[16] 全瑞兰， 王青林， 马汉云， 等. 水稻白化转绿突变体研究进展[J]. 安徽农学通报， 2015， 21（12）： 17-20， 95.
[17] 李红昌， 钱 前， 王 赟， 等. 水稻白穗突变体基因的鉴定和染色体定位[J]. 科学通报， 2003， 48（3）： 268-270.
[18] 从夕汉， 阮新民， 罗志祥， 等. 水稻白穗突变体wp6的发现及研究[J]. 安徽农业科学， 2018， 46（36）： 29-31.
[19] 陈 云， 梁艳玲， 杜双林， 等. 水稻白穗突变体wp7的鉴定及基因定位[J]. 分子植物育种， 2021， 19（12）： 4032-4039.
[20] Wang Y L， Wang C M， Zheng M， et al. WHITE PANICLE1， a val-tRNA synthetase regulating chloroplast ribosome biogenesis in rice， is essential for early chloroplast development[J]. Plant Physiology， 2016， 170（4）： 2110-2123.
[21] Sanchez A C， Khush G S. Chromosomal location of some marker genes in rice using the primary trisomics[J]. The Journal of Heredity， 1994， 85（4）： 297-300.
[22] 李玲鋒， 熊玉毅， 欧阳林娟， 等. 水稻白条纹叶及白穗突变体wlp6的鉴定与基因定位[J]. 中国水稻科学， 2018， 32（6）： 538-548.
[23] 周坤能， 夏加发， 马廷臣， 等. 水稻条纹叶和白穗基因SLWP的定位及变异分析[J]. 中国水稻科学， 2018， 32（4）： 325-334.
[24] 陈叶平， 翟 哲， 杨文君， 等. 水稻条白叶和白穗突变基因St-wp的遗传分析与精细定位[J]. 核农学报， 2015， 29（7）： 1246-1252.
[25] 金 怡， 刘合芹， 汪得凯， 等. 一个水稻苗期白条纹叶及抽穗期白穗突变体的鉴定和基因定位[J]. 中国水稻科学， 2011， 25（5）： 461-466. [26] Zhang Z G， Cui X A， Wang Y W， et al. The RNA editing factor WSP1 is essential for chloroplast development in rice[J]. Molecular Plant， 2017， 10（1）： 86-98.
[27] 陈德西， 李 婷， 曲广林， 等. 水稻条斑和颖花异常突变体st-fon的鉴定与遗传分析[J]. 中国水稻科学， 2012， 26（6）： 677-685.
[28] Song J， Wei X J， Shao G N， et al. The rice nuclear gene WLP1 encoding a chloroplast ribosome L13 protein is needed for chloroplast development in rice grown under low temperature conditions[J]. Plant Molecular Biology， 2014， 84（3）： 301-314.
[29] Iba K， Takamiya K I， Toh Y， et al. Formation of functionally active chloroplasts is determined at a limited stage of leaf development in virescent mutants of rice[J]. Developmental Genetics， 1991， 12（5）： 342-348.
[30] Kusumi K， Sakata C， Nakamura T， et al. A plastid protein NUS1 is essential for build-up of the genetic system for early chloroplast development under cold stress conditions[J]. The Plant Journal， 2011， 68（6）： 1039-1050.
[31] Wu D X， Shen S Q， Cui H R， et al. A novel thermo/photoperiod-sensitive genic male-sterile （T/PGMS） rice mutant with green-revertible albino leaf color marker induced by gamma irradiation[J]. Field Crops Research， 2003， 81（2/3）： 141-147.
責任编辑：黄东杰