【摘 要】
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为研究苦荞金属硫蛋白(FtMT)的生物学功能,制备具有穿膜活性的重组FtMT.采用基因重组技术,分别将FtMT和融合穿膜肽的Tat-FtMT、11R-FtMT编码基因定向克隆至碱性磷酸盐启动子(phoA)分泌型原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3).通过低磷酸盐诱导重组蛋白可溶表达后,经镍柱亲和层析分离纯化,利用SDS-PAGE、Western blot和紫外光谱扫描分析、鉴定.采用电感耦合等离子原子发射光谱仪(ICP-OES)和比色法分析重组FtMT蛋白金属结合特性和羟自由基清除活性.采用免疫荧光
【机 构】
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山西农业大学山西功能食品研究院 太原 030031;特色农产品加工山西省重点实验室 太原 030031;太原理工大学环境科学与工程学院 太原 030024
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为研究苦荞金属硫蛋白(FtMT)的生物学功能,制备具有穿膜活性的重组FtMT.采用基因重组技术,分别将FtMT和融合穿膜肽的Tat-FtMT、11R-FtMT编码基因定向克隆至碱性磷酸盐启动子(phoA)分泌型原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3).通过低磷酸盐诱导重组蛋白可溶表达后,经镍柱亲和层析分离纯化,利用SDS-PAGE、Western blot和紫外光谱扫描分析、鉴定.采用电感耦合等离子原子发射光谱仪(ICP-OES)和比色法分析重组FtMT蛋白金属结合特性和羟自由基清除活性.采用免疫荧光法检测穿膜肽介导的FtMT蛋白的穿膜活性,通过MTT细胞增殖试验分析穿膜肽-FtMT融合蛋白对胰岛细胞Ins-1和心肌细胞H9c2在高糖、高脂及缺氧毒性条件下氧化损伤的保护作用.结果表明,获得纯度较高的可溶性FtMT、Tat-FtMT和11R-FtMT重组蛋白,3种重组蛋白具有几乎一致的金属-巯基簇特征吸收峰,具有较强的金属离子结合能力和羟自由基清除活性.穿膜活性试验证实Tat-FtMT和11R-FtMT蛋白较FtMT具有显著的跨膜转运功能(P<0.05),外源穿膜肽-FtMT融合蛋白可通过跨膜进入胞内,显著降低Ins-1和H9c2由高糖、高脂以及缺氧毒性导致的氧化损伤(P<0.05).试验成功实现了重组穿膜肽-FtMT融合蛋白的表达,在细胞水平分析其抗氧化损伤作用,为FtMT的食药资源开发、应用奠定基础.
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