【摘 要】
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目的 基于分步偶联策略，借助经典的马来酰亚胺-巯基交联反应与异肽键分子粘合方法（SpyTag/SpyCatcher系统），建立抗原与CpG佐剂的定点共价结合技术。方法 设计合成马来酰亚胺修饰的CpG-1018和N端加有半胱氨酸的SpyTag短肽，将二者于20℃震荡孵育以获得中间产物SpyTag-CpG。将SpyCatcher与蛋白抗原Omp19融合表达，通过亲和层析及凝胶过滤层析获得SpyCatc
【机 构】
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军事科学院军事医学研究院生物工程研究所病原微生物生物安全国家重点实验室
【基金项目】
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国家自然科学基金（U20A20361）；
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目的 基于分步偶联策略，借助经典的马来酰亚胺-巯基交联反应与异肽键分子粘合方法（SpyTag/SpyCatcher系统），建立抗原与CpG佐剂的定点共价结合技术。方法 设计合成马来酰亚胺修饰的CpG-1018和N端加有半胱氨酸的SpyTag短肽，将二者于20℃震荡孵育以获得中间产物SpyTag-CpG。将SpyCatcher与蛋白抗原Omp19融合表达，通过亲和层析及凝胶过滤层析获得SpyCatcher-Omp19重组蛋白。通过本实验室构建的志贺氏菌多糖抗原SpyCatcher-OPS糖蛋白表达系统，获得SpyCatcher-OPS糖蛋白。将SpyTag-CpG分别与SpyCatcher-Omp19重组蛋白和SpyCatcher-OPS糖蛋白连接，获得CpG佐剂与抗原共价偶联的终产物CpG-Omp19和CpG-OPS，通过SDS-PAGE后的荧光分析验证终产物的结构。结果 马来酰亚胺和FAM同时标记的CpG-1018和SpyTag连接后，SDS-PAGE检测结果可见对应于SpyTag-CpG交联产物的高分子量条带。马来酰亚胺修饰的CpG-1018与SpyTag连接后，质谱分析结果显示SpyTag-CpG的相对分子质量与其理论相对分子质量相符合。将中间产物SpyTag-CpG与蛋白抗原SpyCatcher-Omp19、多糖抗原SpyCatcher-OPS孵育连接后，考马斯亮蓝染色和FAM荧光检测均可见对应于终产物CpG-Omp19和CpG-OPS的高分子量条带。结论 成功建立基于分步偶联策略的抗原与CpG佐剂定点共价结合技术，获得了CpG佐剂与两种不同类型抗原的偶联终产物CpG-Omp19和CpG-OPS，本研究为未来开发质量可控的自佐剂疫苗奠定了基础。
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