背景:研究表明小鼠胚胎成纤维细胞的制作受多种因素的影响。目前对这些因素的研究均建立于半经验的基础上,缺乏客观定量的数据支持。目的:对小鼠胚胎成纤维细胞制作胚胎干细胞饲养层细胞条件进行优化。方法:用两种不同方法从孕13.5d昆明小鼠胚胎中分离胚胎成纤维细胞,采用锥虫蓝染色计数,比较两种分离方法在细胞活性和数量方面的差异。对分离得到的胚胎成纤维细胞用0.05%胰酶在室温下消化不同时间,分析胰酶消化时间解离贴壁细胞能力和其对细胞活性影响;采用梯度浓度国产丝裂霉素灭活饲养层细胞2h和2.5h并制作细胞生长曲线,探索丝裂霉素最佳浓度和处理时间;通过不同冻存方法比较复苏后胚胎成纤维细胞活性,筛选出适合小鼠胚胎成纤维细胞最佳冻存方法。结果与结论:胚胎成纤维细胞对胰酶极其敏感,短时间多次消化法方法显著提高细胞活性和数量;室温下4～6min胰酶消化时间有利于保存细胞活性;10mg/L2.5h和20mg/L2h丝裂霉素灭活适合制作饲养层细胞;程序性降温使细胞更能适应温度变化,显著提高解冻后细胞活性和数量。