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摘 要：该课题组通过溶剂-非溶剂法将四逆汤制备成具有缓释作用的制剂，增加在胃肠道的停留时间，并考察四逆汤微囊体外表征和体外作用。通过溶剂-非溶剂法制备了四逆汤微囊，并通过单因素实验，确定微囊最佳制备方案。考察四逆汤微囊的体外释放。结果：最终确定囊材质量浓度为15%，囊芯与囊材的比为1：15，转速为400r/min，乙酸乙酯与水的体积比为1：5时微囊的包封率最高，可达82.57%;体外释放结果显示，载药微囊在胃液中少量释放，而在肠溶液中可以达到缓慢释放，最终释放率为57.7%。该实验采用溶剂非溶剂法制备了具有缓释效果的四逆汤微囊。
关键词：四逆汤 微囊 溶剂-非溶剂法 缓控释
中图分类号：R94 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2019）04（c）-0178-04
四逆汤首次在《伤寒杂病论》中被记载，其组方为炙甘草、附子和干姜，是回阳救逆的第一要药。主要是用于四肢发冷、恶寒倦卧、大汗亡阳、脉欲绝、盆腔炎、崩漏[1]等症。现代药理研究发现，其具有强心[2]、调节血压[3]、抗动脉粥样硬化[4-5]等作用。另外，四逆汤在补足人体阳气上有着显著地优势，在“火神派”的治疗中，常作为“扶阳正本”的首选药。若通常为正气不足，脾胃虚弱的肿瘤患者服用以速效为特点的四逆汤不会完全吸收。所以，需要根据其特点制成缓控释制剂，以便容易吸收。
市售四逆汤产品除了常见的汤剂外，还有颗粒剂和滴丸，虽用更方便，但缓释效果不佳。微囊具有保护囊芯和长效释放的作用，可以作为四逆汤新剂型的突破点。
四逆汤主要成分有生物碱，甘草酸，干姜的挥发油等[6]，不能靠单一的方法进行包覆，溶剂非溶剂法可将水相与有机相混合，通过改变搅拌力度等方法制备微囊。我们采用溶剂非溶剂法制备了四逆汤微囊，对其工艺进行优化，为四逆汤缓释制剂的制备提供科学数据和理论支持。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 囊心物的提取
依照2015年版《中国药典》四逆汤制剂规范制备。经醇沉后，冷藏静置24h，滤过，减压浓缩。
1.1.2 四逆汤微囊的制备
取适量的乙基纤维素（Ethyl Cellulose， EC）粉末加入乙酸乙酯溶液中，搅拌均匀，无任何块状物。
取适量四逆湯浸膏溶于饱和乙酸乙酯水溶液中，加入乳化剂，搅拌均匀后，用移液枪加入上述有机溶液中，溶液变为淡黄白色的乳液后继续搅拌1h。滴加过量去离子水，EC在水溶液溶解度变小，形成微囊。继续搅拌一小时，抽滤洗涤，干燥。
1.2 单因素考察
1.2.1 囊材浓度对包封率的影响
以乙基纤维素为囊材，囊芯与囊材的比例为1：9，乳化剂为PEG6000，乳化剂浓度为2%，有机相与水相比为1：5，转速为400r/min。配制不同浓度的有机溶液，依照1.1.2方法制备微囊，观察形貌并计算其包封率。
1.2.2 囊芯与囊材比对包封率的影响
按照1.1.2方法制备微囊，加入不同浓度四逆汤溶液，观察形貌并计算包封率。
1.2.3 搅拌速度对包封率的影响
按照1.1.2方法制备微囊，考察不同转速对微囊影响，观察形貌并计算包封率。
1.2.4 溶剂与水的体积对包封率的影响
按照1.1.2方法制备微囊，考察有机相与水相对微囊影响，观察形貌并计算包封率。
1.3 微囊包封率的测定
取适量微囊样品用甲醇定容，超声成透明溶液后，再定容，摇匀。用紫外分光光度计测微囊的包封率。包封率的计算公式：。式中：w1-微囊中甘草酸的质量（g），w2-投加料中的甘草酸的质量（g）。载药量的计算公式：。式中：z1-微囊中甘草酸的质量（g），z2-微囊的质量（g）。
囊芯四逆汤中含有多种成分，甘草酸只是其中之一，因此分母应乘以甘草酸所占四逆汤总生药量的百分比，实验制得的四逆汤生药量为0.8g/mL。
1.4 标准曲线的绘制
1.4.1 对照品溶液的配制
配制浓度为0.304mg/mL的甘草酸铵标准品溶液，密封冷藏备用。
1.4.2 最大吸收波长的确定
用紫外分光光度仪对定容10mL的标准品进行波长扫描，发现在254nm下吸光度值最大，因此确认最大吸收波长为254nm。
1.4.3 标准曲线的绘制
取不同浓度标准品定容后，在254nm下测得吸光度值。以吸光度（A）值为纵坐标，标准品浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线，进行回归分析。回归方程为：C=0.0767A-0.0003.R2=0.9993，n=6，c=mg/mL。甘草酸铵浓度在0～0.06mg/mL线性关系良好。
1.4.4 稳定性试验
对照品在24h后测试吸光度，结果表明标准品在24h内稳定。
1.5 缓释性能研究
根据《中华人民共和国药典》2015版第二部附录规定，该实验采用小杯法测试微囊在人工胃液和人工肠溶液下体外释放情况。
称取适量四逆汤微囊和少量溶出介质置于透析袋中后，置于温度为37±0.5℃的250mL缓释液中，转速为100r/min，每隔一段时间取和补充相同量缓释液，通过紫外分光光度法检测甘草酸铵的含量计算释放率。
2 结果与讨论
2.1 结果
2.1.1 载药微囊的形貌表征
从图1（a）、（b）上看载药微囊表面平滑，多半为球状，分散性较好，没有粘连现象。整体反应条件温和，在制备和干燥过程中没有碰撞，因此得到的微囊整体形貌较好。 2.2 单因素结果
2.2.1 囊材浓度对包封率的影响
2.2.2 囊芯与囊材比对包封率的影响
2.2.3 溶剂与水的体积对包封率的影响
2.3 缓释性能研究
从图3看，微囊在人工肠液（pH=6.85）的前1h，释放曲线呈急速上升趋势，可能为在微囊浅表层的四逆汤成分，在随后的几小时，开始释放缓慢，6h后释放速率接近42.85%，24h后基本释放完毕，整个过程的释放速率为60.46%，表明甘草酸在人工肠溶液中有一定的缓释作用。在人工胃液（pH=1）中，载药微囊在前2h速率很快，在4h的累计释放速率已经达到26.24%，之后速率下降，12h后累基本释放完全。甘草酸在人工胃液中并不稳定，在全部释放后会呈现降低趋势，但整体上看载药微囊人工胃液的释放很少。
四逆汤对于肿瘤有一定的作用，王倩[7]研究四逆汤对于人肺腺癌细胞A549的作用，發现其能抑制Erk和激活bax通路，使A549肿瘤细胞凋亡。中医认为[8]，肿瘤患者的体内阳气亏损而阴气积累成型，导致体内阴阳失调。戚瑜清[9]从《伤寒论》“典型-非典型-变化”模式下分析四逆汤，以为四逆汤应用为少阴病寒化证。所以，四逆汤能够改善肿瘤患者体内阴阳平衡，达到培元固本，减轻化疗的不适。四逆汤为速效汤剂，对于患者来说，其效过猛。为追求温化扶阳，需要缓释的四逆汤。
我们用溶剂非溶剂法制备四逆汤微囊;通过单因素考察，最终确定最佳工艺条件：囊材浓度为15%，芯材比为1：15，转速为400r/min，乙酸乙酯与水的体积比为1：5;由紫外分光光度法测得微囊的包封率为82.57%，载药量为57.7%;体外释放实验证明四逆汤微囊也有很好的缓释效果。该实验为我们课题组下一步对于中西医结合缓释靶向治疗肿瘤做了前期材料和基础，并为四逆汤缓释剂型的研究提供了科学数据和理论依据。
参考文献
[1] 林雯.四逆汤妇科病临证治验案报道[J].中国民族民间医药，2017（10）：86-87，89.
[2] 张欢欢.基于网络药理学的四逆汤抗心肌缺血损伤的分子机制研究[J].中国现代中药，2018，20（3）：265-277.
[3] 李平.四逆汤联合西药治疗阳虚型高血压的疗效及其对血压变异性的影响[J].中国处方药，2018，16（6）：96-97.
[4] 黄振.四逆汤对实验性高脂血症合并动脉粥样硬化兔SDF-1、VEGF的影响[J].湖南中医杂志，2018，231（5）：174-176.
[5] Zhu Y， Zhao J， Han Q， et al. The Effect and Mechanism of Chinese Herbal Formula Sini Tang in Heart Failure after Myocardial Infarction in Rats[J].2018.Jun 27 ：2018.
[6] 张雯.基于有效组分的四逆汤成药性研究[D].第二军医大学，2015.
[7] 王倩.四逆汤诱导肺腺癌A549细胞凋亡及对MAPK信号通路影响研究[D].南京中医药大学，2017.
[8] 夏克春，曾永蕾，郝皖蓉.从“阳化气，阴成形”来探讨恶性肿瘤的形成机制[J].世界中西医结合杂志，2015（4）：573-574.
[9] 戚瑜清，李成卫，王庆国.基于“典型-非典型-变化”模式分析四逆汤类方[J].中医杂志，2018（16）：6-8，17.
关键词：四逆汤 微囊 溶剂-非溶剂法 缓控释
中图分类号：R94 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2019）04（c）-0178-04
四逆汤首次在《伤寒杂病论》中被记载，其组方为炙甘草、附子和干姜，是回阳救逆的第一要药。主要是用于四肢发冷、恶寒倦卧、大汗亡阳、脉欲绝、盆腔炎、崩漏[1]等症。现代药理研究发现，其具有强心[2]、调节血压[3]、抗动脉粥样硬化[4-5]等作用。另外，四逆汤在补足人体阳气上有着显著地优势，在“火神派”的治疗中，常作为“扶阳正本”的首选药。若通常为正气不足，脾胃虚弱的肿瘤患者服用以速效为特点的四逆汤不会完全吸收。所以，需要根据其特点制成缓控释制剂，以便容易吸收。
市售四逆汤产品除了常见的汤剂外，还有颗粒剂和滴丸，虽用更方便，但缓释效果不佳。微囊具有保护囊芯和长效释放的作用，可以作为四逆汤新剂型的突破点。
四逆汤主要成分有生物碱，甘草酸，干姜的挥发油等[6]，不能靠单一的方法进行包覆，溶剂非溶剂法可将水相与有机相混合，通过改变搅拌力度等方法制备微囊。我们采用溶剂非溶剂法制备了四逆汤微囊，对其工艺进行优化，为四逆汤缓释制剂的制备提供科学数据和理论支持。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 囊心物的提取
依照2015年版《中国药典》四逆汤制剂规范制备。经醇沉后，冷藏静置24h，滤过，减压浓缩。
1.1.2 四逆汤微囊的制备
取适量的乙基纤维素（Ethyl Cellulose， EC）粉末加入乙酸乙酯溶液中，搅拌均匀，无任何块状物。
取适量四逆湯浸膏溶于饱和乙酸乙酯水溶液中，加入乳化剂，搅拌均匀后，用移液枪加入上述有机溶液中，溶液变为淡黄白色的乳液后继续搅拌1h。滴加过量去离子水，EC在水溶液溶解度变小，形成微囊。继续搅拌一小时，抽滤洗涤，干燥。
1.2 单因素考察
1.2.1 囊材浓度对包封率的影响
以乙基纤维素为囊材，囊芯与囊材的比例为1：9，乳化剂为PEG6000，乳化剂浓度为2%，有机相与水相比为1：5，转速为400r/min。配制不同浓度的有机溶液，依照1.1.2方法制备微囊，观察形貌并计算其包封率。
1.2.2 囊芯与囊材比对包封率的影响
按照1.1.2方法制备微囊，加入不同浓度四逆汤溶液，观察形貌并计算包封率。
1.2.3 搅拌速度对包封率的影响
按照1.1.2方法制备微囊，考察不同转速对微囊影响，观察形貌并计算包封率。
1.2.4 溶剂与水的体积对包封率的影响
按照1.1.2方法制备微囊，考察有机相与水相对微囊影响，观察形貌并计算包封率。
1.3 微囊包封率的测定
取适量微囊样品用甲醇定容，超声成透明溶液后，再定容，摇匀。用紫外分光光度计测微囊的包封率。包封率的计算公式：。式中：w1-微囊中甘草酸的质量（g），w2-投加料中的甘草酸的质量（g）。载药量的计算公式：。式中：z1-微囊中甘草酸的质量（g），z2-微囊的质量（g）。
囊芯四逆汤中含有多种成分，甘草酸只是其中之一，因此分母应乘以甘草酸所占四逆汤总生药量的百分比，实验制得的四逆汤生药量为0.8g/mL。
1.4 标准曲线的绘制
1.4.1 对照品溶液的配制
配制浓度为0.304mg/mL的甘草酸铵标准品溶液，密封冷藏备用。
1.4.2 最大吸收波长的确定
用紫外分光光度仪对定容10mL的标准品进行波长扫描，发现在254nm下吸光度值最大，因此确认最大吸收波长为254nm。
1.4.3 标准曲线的绘制
取不同浓度标准品定容后，在254nm下测得吸光度值。以吸光度（A）值为纵坐标，标准品浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线，进行回归分析。回归方程为：C=0.0767A-0.0003.R2=0.9993，n=6，c=mg/mL。甘草酸铵浓度在0～0.06mg/mL线性关系良好。
1.4.4 稳定性试验
对照品在24h后测试吸光度，结果表明标准品在24h内稳定。
1.5 缓释性能研究
根据《中华人民共和国药典》2015版第二部附录规定，该实验采用小杯法测试微囊在人工胃液和人工肠溶液下体外释放情况。
称取适量四逆汤微囊和少量溶出介质置于透析袋中后，置于温度为37±0.5℃的250mL缓释液中，转速为100r/min，每隔一段时间取和补充相同量缓释液，通过紫外分光光度法检测甘草酸铵的含量计算释放率。
2 结果与讨论
2.1 结果
2.1.1 载药微囊的形貌表征
从图1（a）、（b）上看载药微囊表面平滑，多半为球状，分散性较好，没有粘连现象。整体反应条件温和，在制备和干燥过程中没有碰撞，因此得到的微囊整体形貌较好。 2.2 单因素结果
2.2.1 囊材浓度对包封率的影响
2.2.2 囊芯与囊材比对包封率的影响
2.2.3 溶剂与水的体积对包封率的影响
2.3 缓释性能研究
从图3看，微囊在人工肠液（pH=6.85）的前1h，释放曲线呈急速上升趋势，可能为在微囊浅表层的四逆汤成分，在随后的几小时，开始释放缓慢，6h后释放速率接近42.85%，24h后基本释放完毕，整个过程的释放速率为60.46%，表明甘草酸在人工肠溶液中有一定的缓释作用。在人工胃液（pH=1）中，载药微囊在前2h速率很快，在4h的累计释放速率已经达到26.24%，之后速率下降，12h后累基本释放完全。甘草酸在人工胃液中并不稳定，在全部释放后会呈现降低趋势，但整体上看载药微囊人工胃液的释放很少。
四逆汤对于肿瘤有一定的作用，王倩[7]研究四逆汤对于人肺腺癌细胞A549的作用，發现其能抑制Erk和激活bax通路，使A549肿瘤细胞凋亡。中医认为[8]，肿瘤患者的体内阳气亏损而阴气积累成型，导致体内阴阳失调。戚瑜清[9]从《伤寒论》“典型-非典型-变化”模式下分析四逆汤，以为四逆汤应用为少阴病寒化证。所以，四逆汤能够改善肿瘤患者体内阴阳平衡，达到培元固本，减轻化疗的不适。四逆汤为速效汤剂，对于患者来说，其效过猛。为追求温化扶阳，需要缓释的四逆汤。
我们用溶剂非溶剂法制备四逆汤微囊;通过单因素考察，最终确定最佳工艺条件：囊材浓度为15%，芯材比为1：15，转速为400r/min，乙酸乙酯与水的体积比为1：5;由紫外分光光度法测得微囊的包封率为82.57%，载药量为57.7%;体外释放实验证明四逆汤微囊也有很好的缓释效果。该实验为我们课题组下一步对于中西医结合缓释靶向治疗肿瘤做了前期材料和基础，并为四逆汤缓释剂型的研究提供了科学数据和理论依据。
参考文献
[1] 林雯.四逆汤妇科病临证治验案报道[J].中国民族民间医药，2017（10）：86-87，89.
[2] 张欢欢.基于网络药理学的四逆汤抗心肌缺血损伤的分子机制研究[J].中国现代中药，2018，20（3）：265-277.
[3] 李平.四逆汤联合西药治疗阳虚型高血压的疗效及其对血压变异性的影响[J].中国处方药，2018，16（6）：96-97.
[4] 黄振.四逆汤对实验性高脂血症合并动脉粥样硬化兔SDF-1、VEGF的影响[J].湖南中医杂志，2018，231（5）：174-176.
[5] Zhu Y， Zhao J， Han Q， et al. The Effect and Mechanism of Chinese Herbal Formula Sini Tang in Heart Failure after Myocardial Infarction in Rats[J].2018.Jun 27 ：2018.
[6] 张雯.基于有效组分的四逆汤成药性研究[D].第二军医大学，2015.
[7] 王倩.四逆汤诱导肺腺癌A549细胞凋亡及对MAPK信号通路影响研究[D].南京中医药大学，2017.
[8] 夏克春，曾永蕾，郝皖蓉.从“阳化气，阴成形”来探讨恶性肿瘤的形成机制[J].世界中西医结合杂志，2015（4）：573-574.
[9] 戚瑜清，李成卫，王庆国.基于“典型-非典型-变化”模式分析四逆汤类方[J].中医杂志，2018（16）：6-8，17.