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摘要木质素紧密结合在纤维素外层，由于其结构的复杂性和稳定性，是纤维素资源利用中的一大障碍。目前微生物降解木质素的研究主要集中在以白腐菌为代表的真菌上，细菌在木质素降解中的作用有待研究。试验从洋葱腐烂茎秆中取土样，经过碱木质素为唯一碳源的限制性筛选和继代培养，并以愈创木酚为唯一碳源的培养基进行显色反应，最终得到了一株具有木质素分解能力的细菌。通过16S rDNA和gyrB基因测序对该菌株进行鉴定，发现该细菌属于泛菌属。与泛菌属的植物病原菌不同，该细菌不具备致病性，可用于进一步的木质素的细菌分解以及纤维素的综合利用研究。
关键词木质素；分解；泛菌
中图分类号S182文献标识码A文章编号0517-6611（2014）09-02559-02
基金项目黑龙江八一农垦大学校级大学生创新创业训练计划项目。
作者简介蔡红丹（1991- ），女，黑龙江大庆人，本科，专业：生物技术。*通讯作者，副教授，从事微生物资源利用研究。
木质素是由苯丙烷结构单元通过醚键和碳碳键连接而成的聚酚类三维网状高分子芳香族化合物，在自然界中分布非常广泛，主要存在于木本和草本植物的茎秆中。木质素紧密包围在纤维素的纤维外层，由于其结构复杂，分子量大，很难被微生物吸收利用，因此成为了纤维素资源利用中的一个障碍。
在自然界中，木质素的微生物分解是由真菌、细菌等各种微生物群落共同作用的结果[1]。目前，木质素的微生物分解研究主要集中在以白腐真菌为代表的真菌上。白腐真菌能够分泌胞外氧化酶降解木质素，包括木质素过氧化物酶（Lignin peroxidase，LiP）、锰过氧化物酶（Manganesedependent peroxidase，MnP）和漆酶 （Laccase），因此被认为是最主要的木质素降解微生物[2-3]。虽然此类真菌具有较好的分解效果，但若要将其应用到去除纤维素外层的木质素的生产应用中，存在2个严重问题：一是白腐真菌的生长缓慢，产酶量低，难以放大到工业化生产应用；二是白腐真菌在分解木质素的同时必须以纤维素为碳源维持自身生长，会导致降解木质素的同时也降解纤维素，达不到纤维素资源有效利用的目的。因此，有必要寻找其他途径来实现木质素的快速分解和纤维素的有效利用。
细菌降解木质素的能力较真菌差，但是由于细菌的生长周期短，易于培养，适合大规模生产应用。此外，在木质素的降解过程中，细菌发挥了一些关键性作用，如支链的改性、环开裂和解聚等。因此，细菌在木质素分解中的作用也不容忽视[4-5]。在细菌分解木质素的研究中，发现了一部分对木质素有降解效果的细菌，主要包括链霉菌（Streptomyces）、节杆菌（Arthrobacter）、小单孢菌（Micromonospora）等放线菌，还有假单胞菌（Pseudomonas）、黄杆菌（Flavobacterium）等非丝状细菌[6-8]。这些细菌能够分解不同聚合形态的木质素，在木质素降解的不同阶段发挥作用。此外，有一些研究报道了这些菌株能够分泌一些过氧化物酶类，可以对木质素的一种人工聚合形式——硫酸盐木质素进行降解[9]。这说明细菌在降解木质素的过程中发挥着不可或缺的作用，针对细菌对木质素降解的研究值得进一步开展。笔者针对以上问题，开展了能够分解木质素的细菌的筛选工作，并通过16S rDNA和gyrB基因测序对该菌株进行鉴定，以期为分解木质素的细菌的进一步研究提供依据。
1材料与方法
1.1材料从洋葱腐烂茎秆中取样，经过碱木质素为唯一碳源的限制性筛选和继代培养，并经过愈创木酚为唯一碳源的显色反应，最终得到一株具有木质素分解能力的细菌，
1.2方法
1.2.1微量元素混合液。FeCl3·6H2O 0.16 g，ZnSO4·7H2O 1.5 g，CoCl2·6H2O 0.16 g，CuSO4·5H2O 0.15 g，MnSO4·H2O 1.5 g，H3BO3 0.3 g，Na2MoO4·2H2O 0.1 g，蒸馏水定容至1 L，使用前使用0.22 μm滤器过滤除菌。
1.2.2初次选择培养基。碱木质素 1.0 g，NaNO3 2.5 g，KH2PO4 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl2 0.1 g，微量元素混合液1.0 ml，蒸馏水定容至1 L，pH 5.0，121 ℃下湿热灭菌30 min。
1.2.3 2次选择培养基。愈创木酚 1.0 g，NaNO3 2.5 g，KH2PO4 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl2 0.1 g，微量元素混合液1.0 ml，蒸馏水定容至1 L，pH 5.0，121 ℃下湿热灭菌30 min。
1.2.4LB固体平板。蛋白胨10 g，酵母粉 5 g，NaCl 10 g，琼脂粉 15 g，蒸馏水定容至1 L，pH 7.0，121 ℃下湿热灭菌30 min，冷却后倒入培养皿。
1.2.5目的菌株的筛选。从洋葱腐烂茎秆中取土样1.00 g，加入含有玻璃珠的200 ml三角瓶中，加蒸馏水50 ml，于150 r/min振荡1 h，静置5 min，取悬浮液以10%的接种量加入到100 ml初次选择培养基中，26 ℃、150 r/min振荡培养5 d。将培养液以10%的接种量加入到100 ml初次选择培养基中，循环培养5次。
取悬浮培养液涂布到LB固体平板上，37 ℃倒置静止培养24 h，得到布满单克隆的平板。挑取不同外观的克隆接种到5 ml的2次选择培养基中，26 ℃、150 r/min振荡培养5 d，观察颜色反应，培养液颜色变为紫红色的即为目的菌株。取目的菌株的悬浮培养液涂布到LB固体平板上，37 ℃倒置静止培养24 h，单克隆的目的菌株。
1.2.6目的菌株的鉴定。为了对该菌株进行分子鉴定，使用细菌16S rDNA 引物对该菌株进行PCR扩增，引物为：784F（AGGATTAGATACCCTGGTA） 和1061R （CGACACGAGCTGA- CGAC）。PCR扩增条件为：95 ℃预变性 10 min；95 ℃，30 s，50 ℃，30 s，72 ℃，30 s，44个循环；72 ℃延伸10 min。取5 μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定后，其余PCR产物通过PCR产物纯化试剂盒进行纯化，连同引物送交华大基因测序。
为了进一步鉴定该菌株，针对Pantoea ananatis的gyrB基因的保守区进行引物设计。上游引物为GGTGGTATCCGTACAAGTA，下游引物为GAAACGCCTCGTTCTTGC。PCR扩增条件为：95 ℃预变性 10 min；95 ℃，30 s，50 ℃，30 s，72 ℃，30 s，44个循环；72 ℃延伸10 min。取5 μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定后，其余PCR产物通过PCR产物纯化试剂盒进行纯化，连同引物送交华大基因测序。将该菌株的16S rDNA和GyrB基因序列利用NCBI Blast数据库进行同源性分析，使用MEGA软件构建系统发育树。
2结果与分析
2.1目的菌株的获得试验从洋葱腐烂茎秆中取样，经过碱木质素为唯一碳源的选择性培养后，得到4种不同外观的克隆；将这4种克隆分别加入愈创木酚为唯一碳源的2次选择培养基后，仅有1种克隆发生了颜色反应，使培养液颜色变为紫红色。经过初步的生理鉴定，该菌株为革兰氏阴性菌，菌落外观形态为圆形，颜色为不透明乳白色，长时间培养后会呈现黄色（图1）。
3结论与讨论
关键词木质素；分解；泛菌
中图分类号S182文献标识码A文章编号0517-6611（2014）09-02559-02
基金项目黑龙江八一农垦大学校级大学生创新创业训练计划项目。
作者简介蔡红丹（1991- ），女，黑龙江大庆人，本科，专业：生物技术。*通讯作者，副教授，从事微生物资源利用研究。
木质素是由苯丙烷结构单元通过醚键和碳碳键连接而成的聚酚类三维网状高分子芳香族化合物，在自然界中分布非常广泛，主要存在于木本和草本植物的茎秆中。木质素紧密包围在纤维素的纤维外层，由于其结构复杂，分子量大，很难被微生物吸收利用，因此成为了纤维素资源利用中的一个障碍。
在自然界中，木质素的微生物分解是由真菌、细菌等各种微生物群落共同作用的结果[1]。目前，木质素的微生物分解研究主要集中在以白腐真菌为代表的真菌上。白腐真菌能够分泌胞外氧化酶降解木质素，包括木质素过氧化物酶（Lignin peroxidase，LiP）、锰过氧化物酶（Manganesedependent peroxidase，MnP）和漆酶 （Laccase），因此被认为是最主要的木质素降解微生物[2-3]。虽然此类真菌具有较好的分解效果，但若要将其应用到去除纤维素外层的木质素的生产应用中，存在2个严重问题：一是白腐真菌的生长缓慢，产酶量低，难以放大到工业化生产应用；二是白腐真菌在分解木质素的同时必须以纤维素为碳源维持自身生长，会导致降解木质素的同时也降解纤维素，达不到纤维素资源有效利用的目的。因此，有必要寻找其他途径来实现木质素的快速分解和纤维素的有效利用。
细菌降解木质素的能力较真菌差，但是由于细菌的生长周期短，易于培养，适合大规模生产应用。此外，在木质素的降解过程中，细菌发挥了一些关键性作用，如支链的改性、环开裂和解聚等。因此，细菌在木质素分解中的作用也不容忽视[4-5]。在细菌分解木质素的研究中，发现了一部分对木质素有降解效果的细菌，主要包括链霉菌（Streptomyces）、节杆菌（Arthrobacter）、小单孢菌（Micromonospora）等放线菌，还有假单胞菌（Pseudomonas）、黄杆菌（Flavobacterium）等非丝状细菌[6-8]。这些细菌能够分解不同聚合形态的木质素，在木质素降解的不同阶段发挥作用。此外，有一些研究报道了这些菌株能够分泌一些过氧化物酶类，可以对木质素的一种人工聚合形式——硫酸盐木质素进行降解[9]。这说明细菌在降解木质素的过程中发挥着不可或缺的作用，针对细菌对木质素降解的研究值得进一步开展。笔者针对以上问题，开展了能够分解木质素的细菌的筛选工作，并通过16S rDNA和gyrB基因测序对该菌株进行鉴定，以期为分解木质素的细菌的进一步研究提供依据。
1材料与方法
1.1材料从洋葱腐烂茎秆中取样，经过碱木质素为唯一碳源的限制性筛选和继代培养，并经过愈创木酚为唯一碳源的显色反应，最终得到一株具有木质素分解能力的细菌，
1.2方法
1.2.1微量元素混合液。FeCl3·6H2O 0.16 g，ZnSO4·7H2O 1.5 g，CoCl2·6H2O 0.16 g，CuSO4·5H2O 0.15 g，MnSO4·H2O 1.5 g，H3BO3 0.3 g，Na2MoO4·2H2O 0.1 g，蒸馏水定容至1 L，使用前使用0.22 μm滤器过滤除菌。
1.2.2初次选择培养基。碱木质素 1.0 g，NaNO3 2.5 g，KH2PO4 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl2 0.1 g，微量元素混合液1.0 ml，蒸馏水定容至1 L，pH 5.0，121 ℃下湿热灭菌30 min。
1.2.3 2次选择培养基。愈创木酚 1.0 g，NaNO3 2.5 g，KH2PO4 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl2 0.1 g，微量元素混合液1.0 ml，蒸馏水定容至1 L，pH 5.0，121 ℃下湿热灭菌30 min。
1.2.4LB固体平板。蛋白胨10 g，酵母粉 5 g，NaCl 10 g，琼脂粉 15 g，蒸馏水定容至1 L，pH 7.0，121 ℃下湿热灭菌30 min，冷却后倒入培养皿。
1.2.5目的菌株的筛选。从洋葱腐烂茎秆中取土样1.00 g，加入含有玻璃珠的200 ml三角瓶中，加蒸馏水50 ml，于150 r/min振荡1 h，静置5 min，取悬浮液以10%的接种量加入到100 ml初次选择培养基中，26 ℃、150 r/min振荡培养5 d。将培养液以10%的接种量加入到100 ml初次选择培养基中，循环培养5次。
取悬浮培养液涂布到LB固体平板上，37 ℃倒置静止培养24 h，得到布满单克隆的平板。挑取不同外观的克隆接种到5 ml的2次选择培养基中，26 ℃、150 r/min振荡培养5 d，观察颜色反应，培养液颜色变为紫红色的即为目的菌株。取目的菌株的悬浮培养液涂布到LB固体平板上，37 ℃倒置静止培养24 h，单克隆的目的菌株。
1.2.6目的菌株的鉴定。为了对该菌株进行分子鉴定，使用细菌16S rDNA 引物对该菌株进行PCR扩增，引物为：784F（AGGATTAGATACCCTGGTA） 和1061R （CGACACGAGCTGA- CGAC）。PCR扩增条件为：95 ℃预变性 10 min；95 ℃，30 s，50 ℃，30 s，72 ℃，30 s，44个循环；72 ℃延伸10 min。取5 μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定后，其余PCR产物通过PCR产物纯化试剂盒进行纯化，连同引物送交华大基因测序。
为了进一步鉴定该菌株，针对Pantoea ananatis的gyrB基因的保守区进行引物设计。上游引物为GGTGGTATCCGTACAAGTA，下游引物为GAAACGCCTCGTTCTTGC。PCR扩增条件为：95 ℃预变性 10 min；95 ℃，30 s，50 ℃，30 s，72 ℃，30 s，44个循环；72 ℃延伸10 min。取5 μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定后，其余PCR产物通过PCR产物纯化试剂盒进行纯化，连同引物送交华大基因测序。将该菌株的16S rDNA和GyrB基因序列利用NCBI Blast数据库进行同源性分析，使用MEGA软件构建系统发育树。
2结果与分析
2.1目的菌株的获得试验从洋葱腐烂茎秆中取样，经过碱木质素为唯一碳源的选择性培养后，得到4种不同外观的克隆；将这4种克隆分别加入愈创木酚为唯一碳源的2次选择培养基后，仅有1种克隆发生了颜色反应，使培养液颜色变为紫红色。经过初步的生理鉴定，该菌株为革兰氏阴性菌，菌落外观形态为圆形，颜色为不透明乳白色，长时间培养后会呈现黄色（图1）。
3结论与讨论