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摘要 采用分子标记的方法，对印度圆粒小麦Waxy蛋白基因进行了评价和鉴定。结果表明，该方法能较好地检测位点的变异，28份供试材料共有2种变异类型，其中缺失Wx-B1亚基有7份。本文还对这些材料的利用进行了探讨。
关键词 印度圆粒小麦；Waxy基因；分子鉴定
中图分类号 S512.1 文献标识码 A 文章編号 1007-5739（2017）24-0001-02
Molecular Identification of Waxy Gene in Triticum sphaerococcum
SHU Xiao-xia
（Chengdu Agriculture College，Wenjiang Sichuan 611130）
Abstract Using the specific molecular markers，the genetic variations of the waxy gene locus in T.sphaerococcum were identified. The results showed that the method of molecular marker was more facilitate than others for the evaluation of waxy gene.There were two types variation in twenty-eight accessions，and loss Wx-B1 in seven accessions. The utility of these materials were also discussed.
Key words Triticum sphaerococcum；waxy gene；molecular identification
普通小麦籽粒胚乳中含有分子量分别为62.8、56.7、58.7 kD的3种Waxy蛋白亚基，分别由位于7AS、4AL、7DS的Wx-A1、Wx-B1、Wx-D1基因位点编码[1-2]。前人研究表明，4AL末端上荷载有Wx位点的一个较小的染色体片断曾与7BS上的一个小片断发生过染色体相互易位。Waxy蛋白相对含量与直链淀粉含量成高度正相关，亚基的缺失可降低小麦直链淀粉含量。
研究者们发现，六倍体Wx基因及其编码的Wx蛋白的作用机制比二倍体植物复杂得多。不同Waxy蛋白亚基对直链淀粉合成的影响程度不同[3-4]。双缺失型只有Wx-A1和Wx-B1以天然形式存在。普通小麦中Wx-B1缺失型最常见，而Wx-D1缺失型非常罕见。缺失全部3个Waxy蛋白亚基的普通小麦称为糯小麦，其籽粒胚乳直链淀粉含量接近于零[5-6]。优质小麦品种一般缺失Wx-B1亚基，直链淀粉含量较低 [7-8]。
印度圆粒小麦是小麦属六倍体裸粒栽培种之一，染色体数2n=6x=42，染色体组型为AABBDD，具有烘烤品质好及适合做通心粉的特性。因此，本研究利用特异性分子标记，对引进的一批印度圆粒小麦的Waxy蛋白位点遗传多样性进行分析，深入了解变异情况。
1 材料与方法
1.1 供试材料
材料为28份印度圆粒小麦，以中国春作为对照，具体各品种来源见表1，种子均由四川农业大学小麦研究所提供。
1.2 鉴定方法
1.2.1 DNA的提取。参照CTAB法。
1.2.2 引物。引物设计参照McLauchlan A[9]。下游引物：5′-TCG TAC CCG TCG ATG AAG TCG A-3′，上游引物：5′-AAG AGC AAC TAC CAG T-3′。
PCR反应体系：25 μL总体积中含有rTaq聚合酶0.5 μL、模板DNA 1 μL、0.5 μL引物、dNTP 1.0 μL、2.5 xbuffer、超纯水19 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性3 min，94 ℃变性1 min，64 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循环12次；94 ℃变性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，共循环34次，最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统拍照[10-14]。
2 结果与分析
从电泳结果看，扩增产物最少的为2条带（图1），最多为3条带，但多数为3条带，片段大小在200～400 kB之间。对照中国春在3个位点均有扩增产物。供试28份材料中有21份在3个位点也均有扩增产物，占75%。Wx-B1缺失类型共有7份材料，占25%，分别为来源于印度地区的材料PI324492、PI282451、PI42014、PI352498、PI282452和来源巴基斯坦旁遮普的材料PI40941、PI40943（表2）。
3 结论与讨论
3.1 印度圆粒小麦的Waxy基因位点特异性
印度圆粒小麦是改良普通小麦的重要基因资源，它具有多个优异属性，例如蛋白质含量较高，部分蛋白质含量高达21.1%[1]。通常普通小麦籽粒的蛋白质的平均含量在13%左右。
1975年Semenova LV等将印度和巴基斯坦的49份印度圆粒小麦材料进行栽培研究，结果显示，其中11份材料的蛋白质含量高于18%，较普通小麦高出0.1%～3.2%。蛋白质对小麦制品的优劣具有重要作用[8]，印度圆粒小麦具有烘烤品质好及适合做通心粉的特性。
而本研究对印度圆粒小麦控制淀粉品质的Waxy基因位点的分析表明，只有2种变异类型出现在印度圆粒小麦群体中。其优势类型为3个位点均具有扩增产物的野生型，其在糯质小麦的选育中作用不大。但仍有7份材料在Wx-B1位点出现了缺失，可以在糯质小麦育种中加以应用。同时注意到，这7份材料主要分布在印度和巴基斯坦，表明在其主要分布区具有变异类型。 3.2 糯性（Waxy）小麦的产生途径
在大多数禾谷类作物中，都存在糯性（Waxy）品种或糯性变异材料。
Nakamura等[5，15]收集了多个国家和地区的1 960份小麦材料进行研究，进一步证实了小麦的Waxy（Wx）蛋白数量与直链淀粉含量密切相关[16-19]。因此，从小麦近缘属种中筛选Waxy基因的各种变异类型，对糯质小麦育种具有重要的意义[20-23]。而对本研究筛选到的材料，还需作进一步深入的评价和研究[24-25]。
4 参考文献
[1] AINSWORTH C，CLARK J，BALSDON J.Expression organization an dstru-cture of the genes encoding the Waxy protein（granule-bound starch synthase）in wheat[J].Plant Molecular Biology，1993，22：67-82.
[2] YAMAMORI M，NAKAMURA T，ENDO T R，et al.Waxy proteindeficie-ncy and chromosomal location of coding genes in common wheat[J].Theoretical and Applied Genetics，1 994，89：179-184.
[3] YAMAMORI M，QUYNH N T.Differential effects of Wx-A1.B1 and DI protein deficiencies on apparent amylose content and starch pasting prope rties in common wheat[J].Theoretical and Applied Genetics，2000， 100：32-38.
[4] M IURA H，W ICKRAMASINGHE M H A，SUBASINGHE R M，et al.Development of near-isogenic Lines of wheat carrying different null W x alleles an d their starch prope rties[J].Euphytica，2002，123：353-359.
[5] NAKAMURA T，YAMAMORI M，HIRANO H，et al.Identification of three WX proteins in wheat（Triticum aestivum L.）[J].Biochemical Genetics， 1993，31：75-87.
[6] 杜小燕，郝晨阳，张学勇，等.我国部分小麦地方品种Waxy基因多样性研究[J].作物学报，2007（3）：503-506.
[7] ZHAO X C，BATEY I L，SHARP P J，et al.A single genetic locus associated with starchgranule proterties and noodle quality in wheat[J].Journal of CerealScience，1998，27：7-13.
[8] NAKAMURA T，YAMAMORI M，HIRANO H，et al.Decrease of waxy（Wx）protein in two common wheat cultivars withlow amylose content[J].P1ant Breeding，l993，111：99-105.
[9] MCLAUCHLAN A，OGBONNAYA FC，HOLLINGSWORTH B，et al.Dev-elopment of robust PCR-based DNA markers for each homoeo-allele of granule-bound starch synthase and their application in wheat breeding programs[J].Appels R.In：Australian Journal of Agricultural Research，2001，52（11-12）：1409-1416.
[10] NAKAMURA T，YAMAMORI M，HIDAKA S，et al.Expression of HMW W protein in Japanese common wheat cultivars[J].Japanese Journal of Breeding，1992，32：68l-685.
[11] SULAIMAN BD，MORRISON W R.Proteins associated with the surface of wheat starch granules purified by centrifuging through caesium chloride[J].Journal of Cereal Science，1990，12：53-61.
[12] 姚大年，孫辉，刘广田，等.小麦糯性（Waxy）蛋白的研究与利用[J].中国粮油学报，1999，14（6）：4.
[13] SHARIFLOU M R，SHARP P J.A polymorphic microsatellite in the 3 end of ′waxy′genes ofwheat，Triticum aestivum[J].Plant Breeding，1999， 118：275-277.
[14] 梁荣奇，张义荣，刘守斌，等.利用Wx基因的分子标记辅助选择培育糯性小麦[J].遗传学报，2001，28（9）：856-863.
[15] NAKAMURA T，YAMAMORI M，HIRANO H.The waxy（Wx）protein of maize，rice and barley[J].Phytochemistry，1993，33：749-753.
[16] 李春，宋广芝，田纪春.糯小麦及其Waxy基因的研究进展[J].中国农学通报，2007（7）：257-262.
[17] 晏本菊.中国小麦微核心种质Waxy基因的PCR鉴定及分析[C]//中国遗传学会基因组学专业委员会.中国遗传学会功能基因组学研讨会论文集.中国遗传学会基因组学专业委员会，2006：1.
[18] 李加瑞，赵伟，李全梓，等.Waxy基因的RNA沉默使转基因小麦种子中直链淀粉含量下降（英文）[J].遗传学报，2005（8）：846-854.
[19] 刘迎春.小麦Waxy基因的分子标记及其应用[D].南京：南京农业大学，2004.
[20] 任丽娟，蔡士宾，马鸿翔，等.用一个SSR标记快速检测小麦杂种后代Waxy基因型[J].麦类作物学报，2004（3）：9-12.
[21] 李涛，王宏，任芹勇，等.粳糯谷子Waxy基因序列变异及其与禾谷类作物的相似性[J].分子植物育种，2017（增刊1）：1-10.
[22] 肖伟.小麦属Waxy基因5′上游调控区序列变异分析[D].雅安：四川农业大学，2009.
[23] 王海萍.小麦淀粉特性及Waxy基因分子标记研究[D].太原：山西大学，2007.
[24] 刘锐，吴桂玲，张婷，等.糯小麦配粉对小麦粉理化性质及面条品质的影响[J].中国粮油学报，2017，32（9）：15-21.
[25] 刘希伟，张敏，张玉春，等.灌浆期遮光对糯小麦和非糯小麦淀粉组分及理化特性的影响[J].中国农业科学，2017，50（9）：1582-1593.
关键词 印度圆粒小麦；Waxy基因；分子鉴定
中图分类号 S512.1 文献标识码 A 文章編号 1007-5739（2017）24-0001-02
Molecular Identification of Waxy Gene in Triticum sphaerococcum
SHU Xiao-xia
（Chengdu Agriculture College，Wenjiang Sichuan 611130）
Abstract Using the specific molecular markers，the genetic variations of the waxy gene locus in T.sphaerococcum were identified. The results showed that the method of molecular marker was more facilitate than others for the evaluation of waxy gene.There were two types variation in twenty-eight accessions，and loss Wx-B1 in seven accessions. The utility of these materials were also discussed.
Key words Triticum sphaerococcum；waxy gene；molecular identification
普通小麦籽粒胚乳中含有分子量分别为62.8、56.7、58.7 kD的3种Waxy蛋白亚基，分别由位于7AS、4AL、7DS的Wx-A1、Wx-B1、Wx-D1基因位点编码[1-2]。前人研究表明，4AL末端上荷载有Wx位点的一个较小的染色体片断曾与7BS上的一个小片断发生过染色体相互易位。Waxy蛋白相对含量与直链淀粉含量成高度正相关，亚基的缺失可降低小麦直链淀粉含量。
研究者们发现，六倍体Wx基因及其编码的Wx蛋白的作用机制比二倍体植物复杂得多。不同Waxy蛋白亚基对直链淀粉合成的影响程度不同[3-4]。双缺失型只有Wx-A1和Wx-B1以天然形式存在。普通小麦中Wx-B1缺失型最常见，而Wx-D1缺失型非常罕见。缺失全部3个Waxy蛋白亚基的普通小麦称为糯小麦，其籽粒胚乳直链淀粉含量接近于零[5-6]。优质小麦品种一般缺失Wx-B1亚基，直链淀粉含量较低 [7-8]。
印度圆粒小麦是小麦属六倍体裸粒栽培种之一，染色体数2n=6x=42，染色体组型为AABBDD，具有烘烤品质好及适合做通心粉的特性。因此，本研究利用特异性分子标记，对引进的一批印度圆粒小麦的Waxy蛋白位点遗传多样性进行分析，深入了解变异情况。
1 材料与方法
1.1 供试材料
材料为28份印度圆粒小麦，以中国春作为对照，具体各品种来源见表1，种子均由四川农业大学小麦研究所提供。
1.2 鉴定方法
1.2.1 DNA的提取。参照CTAB法。
1.2.2 引物。引物设计参照McLauchlan A[9]。下游引物：5′-TCG TAC CCG TCG ATG AAG TCG A-3′，上游引物：5′-AAG AGC AAC TAC CAG T-3′。
PCR反应体系：25 μL总体积中含有rTaq聚合酶0.5 μL、模板DNA 1 μL、0.5 μL引物、dNTP 1.0 μL、2.5 xbuffer、超纯水19 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性3 min，94 ℃变性1 min，64 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循环12次；94 ℃变性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，共循环34次，最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统拍照[10-14]。
2 结果与分析
从电泳结果看，扩增产物最少的为2条带（图1），最多为3条带，但多数为3条带，片段大小在200～400 kB之间。对照中国春在3个位点均有扩增产物。供试28份材料中有21份在3个位点也均有扩增产物，占75%。Wx-B1缺失类型共有7份材料，占25%，分别为来源于印度地区的材料PI324492、PI282451、PI42014、PI352498、PI282452和来源巴基斯坦旁遮普的材料PI40941、PI40943（表2）。
3 结论与讨论
3.1 印度圆粒小麦的Waxy基因位点特异性
印度圆粒小麦是改良普通小麦的重要基因资源，它具有多个优异属性，例如蛋白质含量较高，部分蛋白质含量高达21.1%[1]。通常普通小麦籽粒的蛋白质的平均含量在13%左右。
1975年Semenova LV等将印度和巴基斯坦的49份印度圆粒小麦材料进行栽培研究，结果显示，其中11份材料的蛋白质含量高于18%，较普通小麦高出0.1%～3.2%。蛋白质对小麦制品的优劣具有重要作用[8]，印度圆粒小麦具有烘烤品质好及适合做通心粉的特性。
而本研究对印度圆粒小麦控制淀粉品质的Waxy基因位点的分析表明，只有2种变异类型出现在印度圆粒小麦群体中。其优势类型为3个位点均具有扩增产物的野生型，其在糯质小麦的选育中作用不大。但仍有7份材料在Wx-B1位点出现了缺失，可以在糯质小麦育种中加以应用。同时注意到，这7份材料主要分布在印度和巴基斯坦，表明在其主要分布区具有变异类型。 3.2 糯性（Waxy）小麦的产生途径
在大多数禾谷类作物中，都存在糯性（Waxy）品种或糯性变异材料。
Nakamura等[5，15]收集了多个国家和地区的1 960份小麦材料进行研究，进一步证实了小麦的Waxy（Wx）蛋白数量与直链淀粉含量密切相关[16-19]。因此，从小麦近缘属种中筛选Waxy基因的各种变异类型，对糯质小麦育种具有重要的意义[20-23]。而对本研究筛选到的材料，还需作进一步深入的评价和研究[24-25]。
4 参考文献
[1] AINSWORTH C，CLARK J，BALSDON J.Expression organization an dstru-cture of the genes encoding the Waxy protein（granule-bound starch synthase）in wheat[J].Plant Molecular Biology，1993，22：67-82.
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[11] SULAIMAN BD，MORRISON W R.Proteins associated with the surface of wheat starch granules purified by centrifuging through caesium chloride[J].Journal of Cereal Science，1990，12：53-61.
[12] 姚大年，孫辉，刘广田，等.小麦糯性（Waxy）蛋白的研究与利用[J].中国粮油学报，1999，14（6）：4.
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[14] 梁荣奇，张义荣，刘守斌，等.利用Wx基因的分子标记辅助选择培育糯性小麦[J].遗传学报，2001，28（9）：856-863.
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[16] 李春，宋广芝，田纪春.糯小麦及其Waxy基因的研究进展[J].中国农学通报，2007（7）：257-262.
[17] 晏本菊.中国小麦微核心种质Waxy基因的PCR鉴定及分析[C]//中国遗传学会基因组学专业委员会.中国遗传学会功能基因组学研讨会论文集.中国遗传学会基因组学专业委员会，2006：1.
[18] 李加瑞，赵伟，李全梓，等.Waxy基因的RNA沉默使转基因小麦种子中直链淀粉含量下降（英文）[J].遗传学报，2005（8）：846-854.
[19] 刘迎春.小麦Waxy基因的分子标记及其应用[D].南京：南京农业大学，2004.
[20] 任丽娟，蔡士宾，马鸿翔，等.用一个SSR标记快速检测小麦杂种后代Waxy基因型[J].麦类作物学报，2004（3）：9-12.
[21] 李涛，王宏，任芹勇，等.粳糯谷子Waxy基因序列变异及其与禾谷类作物的相似性[J].分子植物育种，2017（增刊1）：1-10.
[22] 肖伟.小麦属Waxy基因5′上游调控区序列变异分析[D].雅安：四川农业大学，2009.
[23] 王海萍.小麦淀粉特性及Waxy基因分子标记研究[D].太原：山西大学，2007.
[24] 刘锐，吴桂玲，张婷，等.糯小麦配粉对小麦粉理化性质及面条品质的影响[J].中国粮油学报，2017，32（9）：15-21.
[25] 刘希伟，张敏，张玉春，等.灌浆期遮光对糯小麦和非糯小麦淀粉组分及理化特性的影响[J].中国农业科学，2017，50（9）：1582-1593.