论文部分内容阅读
【摘要】近年来，从枝菌根真菌在土地工程中的应用问题得到了业内的广泛关注，研究其相关课题有着重要意义。本文首先对相关内容做了概述，分析了材料与方法，并结合相关实践经验，分别从多个角度与方面就其结果问题展开了研究，阐述了个人对此的几点看法与认识，望有助于相关工作的实践。
【关键词】从枝菌根真菌；土地工程；应用；研究
1、前言
作为一项实际要求较高的实践性工作，从枝菌根真菌在土地工程中的应用有着其自身的特殊性。该项课题的研究，将会更好地提升对从枝菌根真菌在的分析与掌控力度，从而通过合理化的措施与途径，进一步优化该项工作的最终整体效果。
2、概述
植物内生真菌（endophytefungi）是非常重要的微生物资源，几乎所有植物组织内都存在内生真菌，其发酵产物具丰富的化学多样性和广泛的生物活性。自Strierle等发现红豆杉的内生真菌紫衫霉可产紫杉醇后，引发了利用内生真菌来替代原植物的研究热潮。很多植物中都发现了能够产和宿主相同结构的活性次生代谢产物的内生真菌，如白喉乌头根部的内生真菌芽枝状枝孢（Cladosporiumcladosporioides）可产乌头碱。为保护黄草乌野生植物资源，缓解我国中药资源日益减少与需求量不断增加之间的矛盾，本研究对黄草乌根部的内生真菌进行了分离与鉴定，为黄草乌的中药资源保护和开发利用提供新思路。
3、材料与方法
3.1材料与试剂
黄草乌新鲜健康植株于2015年10月采集于云南省昆明市盘龙区，由昆明医科大学杨淑达副教授鉴定，标本（2015-yc-1）保存于云南大学化学科学与工程学院。葡萄糖、琼脂粉、NaClO购于上海泰坦科技股份有限公司，青霉素及卡那霉素购于阿拉丁，酒精购于天津化学试剂有限公司。
3.2内生真菌的分离与培养
3.2.1分离培养基PDA培养基：去皮马铃薯200g煮沸30min，加入葡萄糖20g，琼脂粉12g，纱布过滤，滤液定容至1000mL，pH自然，121°C灭菌30min。
3.2.2分离与培养黄草乌的根用自来水冲洗干净，截成6～8cm长条，晾干水分后于5%NaClO溶液漂洗60s，无菌水冲洗三次，然后于75%酒精漂洗60s，最后无菌水冲洗三次则表面消毒处理完毕。无菌状态下将根切成2mm3小块，置于分离平板培养基（28±1）°C静止培养，培养基需预先加入青霉素（100mg/L）和卡那霉素（100mg/L）以抑制细菌生长。3～7d后培养基中可见菌落形成，挑取组织周围的菌落转接入PDA斜面。采用平板梯度稀释法纯化分得的内生真菌，根据其主要菌落形态特征（菌落大小、颜色、表面特征和质地）和菌体个体形态特征（菌丝、子实体和孢子形态），按微生物分类的不同将同一类群进行归类。最后将已纯化和归类的菌株分别转入PDA斜面，在（28±1）°C下培养。
3.3内生真菌的鉴定
采用插片培养方法对分离的内生真菌进行显微形态特征的观察、鉴定，在显微镜下观察子实体特征，结合培养特性，将菌株鉴定到属。然后依据不同属的分类标准，参照文献的方法进行种的鉴定。
3.4分子生物学信息分析
在PDA平板上恒温培养内生真菌5d后在无菌条件下用刀片刮取菌丝至1.5mL离心管收集菌丝体。在研钵中用液氮充分研磨菌丝体至粉末状，立即装入1.5mL离心管中，用真菌DNA提取试剂盒提取基因组DNA，置于-20°C冰箱中保存备用。提取基因组DNA后，用引物ITS4进行扩增，扩增产物交由昆明硕擎生物科技有限公司进行测序，测序结果进行Blast比对。
结果：
子囊菌门的菌株在纲、目、科、属等分类水平上具有丰富的多样性，分离鉴定的真菌包括子囊菌门的4纲、7目、9科、16属，其中地丝霉属（Geomyces）和漆斑菌属（Myrothecium）在科的水平上未分类。属于接合菌门的菌株仅有4株2种，都为接合菌纲毛霉菌目毛霉菌科毛霉菌属。另外有4株3种的真菌属于担子菌门，分布于担子菌门的1纲、2目、3科、3属中。在纲的分类水平上，粪壳菌纲有24株，占分离总数的46.2%，包括10属13种。其次为散囊菌纲，有15株，包括2属12种。在目的分类水平上，优势目为肉座菌目，具有18株9种的内生真菌，其次为散囊菌目，有15株12种。丛赤壳科和发菌科为黄草乌的优势菌群，分别有14株6种和15株12种。从属的层面上看，镰刀菌属共分离得到12株4种，是黄草乌内生真菌的优势属种；其次是青霉菌属，有11株9种，曲霉属有4株3种。
讨论：
本研究所得黄草乌根部的内生真菌类群普遍被认为腐生性较强，但是所采集的样本全部来自健康植株，宿主未表现受到伤害或感染病害的症状，应该不会给腐生性真菌提供生长基质。因此认为这些真菌是内生的或至少是部分内生且不引起植物病害，它们符合植物内生真菌的有关定义。本研究还发现镰刀菌属是黄草乌根部内生真菌的优势属种，在本实验中分离得到的4种镰刀菌属的真菌：腐皮镰刀菌、燕麦镰刀菌、三隔镰刀菌、尖孢镰刀菌均被报道能引起植物病害，可以认为是潜伏的致病菌。本研究中亦从黄草乌中分离得到芽枝状枝孢，该菌曾被报道可产生二萜生物碱类化合物乌头碱，本研究所分离得到的芽枝状枝孢是否能在一定的培养条件下产生二萜生物碱则有待进一步研究。
结语：
综上所述，加强对从枝菌根真菌在土地工程中应用的研究，对于其良好实践效果的取得有着十分重要的意义，因此在今后的从枝菌根真菌应用工作过程中，应该加强对其关键环节与重点要素的重视程度，并注重其具体实施措施与方法的科学性。
参考文献：
[1]中国科学院植物志编辑委员会.中国植物志（第27卷）[M].北京：科学出版社.2017（11）：60-62.
[2]趙永堂.新乌头碱，乌头碱与次乌头碱在附子不同炮制法中含量变化的实验研究[J].中国医药导报.2017（01）：115-116.
[3]周皓，杨亚滨，黎唯，等.植物内生菌中生物碱成分研究进展[J].云南民族大学学报：自然科学版.2016（21）：88-89.
【关键词】从枝菌根真菌；土地工程；应用；研究
1、前言
作为一项实际要求较高的实践性工作，从枝菌根真菌在土地工程中的应用有着其自身的特殊性。该项课题的研究，将会更好地提升对从枝菌根真菌在的分析与掌控力度，从而通过合理化的措施与途径，进一步优化该项工作的最终整体效果。
2、概述
植物内生真菌（endophytefungi）是非常重要的微生物资源，几乎所有植物组织内都存在内生真菌，其发酵产物具丰富的化学多样性和广泛的生物活性。自Strierle等发现红豆杉的内生真菌紫衫霉可产紫杉醇后，引发了利用内生真菌来替代原植物的研究热潮。很多植物中都发现了能够产和宿主相同结构的活性次生代谢产物的内生真菌，如白喉乌头根部的内生真菌芽枝状枝孢（Cladosporiumcladosporioides）可产乌头碱。为保护黄草乌野生植物资源，缓解我国中药资源日益减少与需求量不断增加之间的矛盾，本研究对黄草乌根部的内生真菌进行了分离与鉴定，为黄草乌的中药资源保护和开发利用提供新思路。
3、材料与方法
3.1材料与试剂
黄草乌新鲜健康植株于2015年10月采集于云南省昆明市盘龙区，由昆明医科大学杨淑达副教授鉴定，标本（2015-yc-1）保存于云南大学化学科学与工程学院。葡萄糖、琼脂粉、NaClO购于上海泰坦科技股份有限公司，青霉素及卡那霉素购于阿拉丁，酒精购于天津化学试剂有限公司。
3.2内生真菌的分离与培养
3.2.1分离培养基PDA培养基：去皮马铃薯200g煮沸30min，加入葡萄糖20g，琼脂粉12g，纱布过滤，滤液定容至1000mL，pH自然，121°C灭菌30min。
3.2.2分离与培养黄草乌的根用自来水冲洗干净，截成6～8cm长条，晾干水分后于5%NaClO溶液漂洗60s，无菌水冲洗三次，然后于75%酒精漂洗60s，最后无菌水冲洗三次则表面消毒处理完毕。无菌状态下将根切成2mm3小块，置于分离平板培养基（28±1）°C静止培养，培养基需预先加入青霉素（100mg/L）和卡那霉素（100mg/L）以抑制细菌生长。3～7d后培养基中可见菌落形成，挑取组织周围的菌落转接入PDA斜面。采用平板梯度稀释法纯化分得的内生真菌，根据其主要菌落形态特征（菌落大小、颜色、表面特征和质地）和菌体个体形态特征（菌丝、子实体和孢子形态），按微生物分类的不同将同一类群进行归类。最后将已纯化和归类的菌株分别转入PDA斜面，在（28±1）°C下培养。
3.3内生真菌的鉴定
采用插片培养方法对分离的内生真菌进行显微形态特征的观察、鉴定，在显微镜下观察子实体特征，结合培养特性，将菌株鉴定到属。然后依据不同属的分类标准，参照文献的方法进行种的鉴定。
3.4分子生物学信息分析
在PDA平板上恒温培养内生真菌5d后在无菌条件下用刀片刮取菌丝至1.5mL离心管收集菌丝体。在研钵中用液氮充分研磨菌丝体至粉末状，立即装入1.5mL离心管中，用真菌DNA提取试剂盒提取基因组DNA，置于-20°C冰箱中保存备用。提取基因组DNA后，用引物ITS4进行扩增，扩增产物交由昆明硕擎生物科技有限公司进行测序，测序结果进行Blast比对。
结果：
子囊菌门的菌株在纲、目、科、属等分类水平上具有丰富的多样性，分离鉴定的真菌包括子囊菌门的4纲、7目、9科、16属，其中地丝霉属（Geomyces）和漆斑菌属（Myrothecium）在科的水平上未分类。属于接合菌门的菌株仅有4株2种，都为接合菌纲毛霉菌目毛霉菌科毛霉菌属。另外有4株3种的真菌属于担子菌门，分布于担子菌门的1纲、2目、3科、3属中。在纲的分类水平上，粪壳菌纲有24株，占分离总数的46.2%，包括10属13种。其次为散囊菌纲，有15株，包括2属12种。在目的分类水平上，优势目为肉座菌目，具有18株9种的内生真菌，其次为散囊菌目，有15株12种。丛赤壳科和发菌科为黄草乌的优势菌群，分别有14株6种和15株12种。从属的层面上看，镰刀菌属共分离得到12株4种，是黄草乌内生真菌的优势属种；其次是青霉菌属，有11株9种，曲霉属有4株3种。
讨论：
本研究所得黄草乌根部的内生真菌类群普遍被认为腐生性较强，但是所采集的样本全部来自健康植株，宿主未表现受到伤害或感染病害的症状，应该不会给腐生性真菌提供生长基质。因此认为这些真菌是内生的或至少是部分内生且不引起植物病害，它们符合植物内生真菌的有关定义。本研究还发现镰刀菌属是黄草乌根部内生真菌的优势属种，在本实验中分离得到的4种镰刀菌属的真菌：腐皮镰刀菌、燕麦镰刀菌、三隔镰刀菌、尖孢镰刀菌均被报道能引起植物病害，可以认为是潜伏的致病菌。本研究中亦从黄草乌中分离得到芽枝状枝孢，该菌曾被报道可产生二萜生物碱类化合物乌头碱，本研究所分离得到的芽枝状枝孢是否能在一定的培养条件下产生二萜生物碱则有待进一步研究。
结语：
综上所述，加强对从枝菌根真菌在土地工程中应用的研究，对于其良好实践效果的取得有着十分重要的意义，因此在今后的从枝菌根真菌应用工作过程中，应该加强对其关键环节与重点要素的重视程度，并注重其具体实施措施与方法的科学性。
参考文献：
[1]中国科学院植物志编辑委员会.中国植物志（第27卷）[M].北京：科学出版社.2017（11）：60-62.
[2]趙永堂.新乌头碱，乌头碱与次乌头碱在附子不同炮制法中含量变化的实验研究[J].中国医药导报.2017（01）：115-116.
[3]周皓，杨亚滨，黎唯，等.植物内生菌中生物碱成分研究进展[J].云南民族大学学报：自然科学版.2016（21）：88-89.